خبرونه

د Nature.com لیدلو لپاره مننه.د براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).په ورته وخت کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ وړاندې کړو.
د فعالو ایسټرونو یا فینوکسي رادیکالونو پراساس د انزیماتیک قربت لیبل کولو میتودونه په پراخه کچه په ژوندیو حجرو کې د فرعي سیلولر پروټومونو او پروټین متقابل نقشه کولو لپاره کارول کیږي.په هرصورت، فعال شوي ایسټرونه لږ عکس العمل لري، چې په پایله کې د پراخه لیبل کولو وړانګو سبب کیږي، او د پیرو اکسایډ درملنې لخوا رامینځته شوي فینوکسي رادیکالونه کولی شي د ریډکس لارو سره مداخله وکړي.دلته موږ د نږدې لیبل کولو انحصاري فوټوایکټیویشن (PDPL) میتود راپور ورکوو چې د مینی ایس او جی فوټوسینټیزر پروټین د ګټو پروټین سره په جنیټیکي توګه وصل کولو سره رامینځته شوی.د نیلي ر lightا لخوا رامینځته شوی او د افشا کیدو وخت لخوا کنټرول شوی ، واحد اکسیجن تولید کیږي او بیا د انلین تحقیقات لخوا د هسټیډین پاتې شونو لیبل کولو په ځای کې حل کیږي.موږ د ارګانیل ځانګړي پروټوم نقشه کولو له لارې د دې لوړ وفاداري ښیې.د TurboID سره د PDPL یو په بل پسې پرتله کول د PDPL ډیر مشخص او هراړخیز پروټومیک پوښښ ښیې.بیا، موږ PDPL د ناروغۍ پورې تړلي ټرانسکریپشن کواکټیوټر BRD4 او E3 پارکین لیګس ته پلي کړ او دمخه یې نامعلوم متقابل عمل وموندل.د overexpression سکرینینګ په واسطه، د پارکین لپاره دوه نامعلوم سبسټریټونه، Ssu72 او SNW1، پیژندل شوي، چې تخریب یې د ubiquitination-proteasome لارې منځګړیتوب دی.
د پروټین شبکو دقیق ځانګړتیا د ډیری بنسټیزو سیلولر پروسو سره تړاو لري.له همدې امله، د پروټین تعاملاتو خورا دقیق سپیټیوټیمپورل نقشه کول به د بیولوژیکي لارو ، د ناروغۍ رنځپوهنې ، او د معالجوي اهدافو لپاره د دې تعاملاتو ګډوډولو لپاره مالیکول اساس چمتو کړي.د دې لپاره، هغه میتودونه چې د ژوندیو حجرو یا نسجونو کې د لنډمهاله تعاملاتو کشف کولو وړ دي خورا مطلوب دي.د تړاو پاکولو ډله ایز سپیکرومیټري (AP-MS) په تاریخي ډول د ګټو د پروټینونو پابند شریکانو پیژندلو لپاره کارول شوی (POIs).د کمیتي پروټومیک میتودونو په پراختیا سره، Bioplex3.0 رامینځته شو، د AP-MS پر بنسټ د پروټین شبکې ترټولو لوی ډیټابیس.که څه هم AP-MS خورا پیاوړی دی، په کاري جریان کې د حجرو لیسز او کمولو مرحلې د ضعیف او لنډمهاله پابند تعاملاتو په لور متعصب دي او د لیسز وروسته آثار معرفي کوي لکه د لیسیز متقابل عمل جوړه چې د لیسز څخه دمخه د کمپارټیل کولو نشتوالی.
د دې مسلو د حل لپاره، غیر طبیعي امینو اسیدونه (UAA) د کراس لینک کولو ګروپونو سره او د انزیماتیک نږدې لیبل کولو (PL) پلیټ فارمونه (د بیلګې په توګه APEX او BioID) 5 رامینځته شوي.که څه هم د UAA میتود په بریالیتوب سره په ډیری سناریوګانو کې پلي شوی او د مستقیم پروټین چپکونکو په اړه معلومات چمتو کوي، د UAA داخلولو سایټ اصلاح کول لاهم اړین دي.تر ټولو مهم، دا د stoichiometric لیبل کولو طریقه ده چې د لیبل کولو پیښو د کتلیتیک بدلون نشتوالی لري.په مقابل کې، د انزیماتیک PL میتودونه، لکه د BioID میتود، انجینر شوي بایوټین لیګیس POI7 ته فیوز کوي، چې وروسته بیا بایوټین فعالوي ترڅو د بایوټینیل-AMP ایسټر منځګړیتوب فعال کړي.په دې توګه انزایم یو فعال بایوټین "بادل" کټالیز کوي او خوشې کوي چې د نږدې لیسین پاتې شونو لیبل کوي.په هرصورت، BioID د کافي لیبل شوي سیګنال ترلاسه کولو لپاره له 12 ساعتونو څخه ډیر وخت ته اړتیا لري ، کوم چې د لنډمهاله حل سره د هغې کارول منع کوي.د خمیر ښودنې پراساس د لارښود تکامل په کارولو سره ، TurboID د BioID پراساس ډیزاین شوی ترڅو ډیر موثر وي ، په 10 دقیقو کې د بایوټین سره مؤثره لیبل کولو ته اجازه ورکوي ، د ډیرو متحرک پروسو مطالعې ته اجازه ورکوي.ځکه چې TurboID خورا فعال دی او د انډروجینس بایوټین کچه د ټیټې کچې لیبل کولو لپاره کافي ده، د شالید لیبل کول یو احتمالي ستونزه رامینځته کیږي کله چې د exogenous بایوټین اضافه کولو سره خورا لوړ او وختي لیبل کولو ته اړتیا وي.برسېره پردې، فعال شوي ایسټرونه کمزوري تعامل لري (t1/2 ~ 5 min)، کوم چې کولی شي د لوی لیبل کولو وړانګو لامل شي، په ځانګړې توګه د بایوټین 5 سره د ګاونډیو پروټینونو سنتریت وروسته. په یوه بله طریقه کې، د انجینر شوي اسکوربیټ پیرو اکسایډیز جنیټیک فیوژن (یعنې بایوټین- د فینول رادیکالونه او د پروټین لیبل کولو ته اجازه ورکوي په یوه دقیقه کې 9,10. APEX په پراخه کچه د فرعي سیلولر پروټومونو ، جھلی پروټین کمپلیکسونو او سایټوسولیک سیګنال پروټین کمپلیکسونو پیژندلو لپاره کارول کیږي 11,12. په هرصورت ، د پیرو اکسایډونو لوړ غلظت ته اړتیا کولی شي د ریډوکس پروټینونو یا لارې ګډوډي اغیزه وکړي. سیلولر پروسې.
په دې توګه، یو نوی میتود چې د لوړ ځایي او لنډمهاله دقت سره د ډیر عکس العمل لیبل شوي ریډیس سپپریشن ډولونو رامینځته کولو وړتیا لري پرته له دې چې د سیلولر لارې د پام وړ ګډوډ کړي د موجوده میتودونو لپاره به یو مهم اضافه وي. د عکس العمل ډولونو په مینځ کې، واحد اکسیجن د خپل لنډ ژوند او محدود خپریدو وړانګو (t1/2 <0.6 µs په حجرو کې) 13 له امله زموږ پاملرنه راجلب کړه. د عکس العمل ډولونو په مینځ کې، واحد اکسیجن د خپل لنډ ژوند او محدود خپریدو وړانګو (t1/2 <0.6 µs په حجرو کې) 13 له امله زموږ پاملرنه راجلب کړه. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного , ограниченного ограниченного и ограниченного , د فعالو بڼو په منځ کې، واحد اکسیجن د خپل لنډ ژوند او محدود خپریدو وړانګو (t1/2 <0.6 µs په حجرو کې) 13 له امله زموږ پام ځانته راجلب کړ.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 <0.6 µs）争耬. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченновкает и ограниченновкает/ د فعالو شکلونو په منځ کې، واحد اکسیجن د خپل لنډ ژوند او محدود خپریدو وړانګو (t1/2 <0.6 μs په حجرو کې) له امله زموږ پاملرنه راجلبوي.واحد اکسیجن په تصادفي ډول د میتیونین، ټایروسین، هسټیډین او ټریپټوفان اکسیډیز کولو راپور ورکړل شوی، چې دا د امین یا تیول پر بنسټ پروبونو16,17 سره د نښلولو لپاره پولر 14,15 جوړوي.که څه هم سنگلټ اکسیجن د فرعي سیلولر کمپارټمنټ RNA لیبل کولو لپاره کارول شوی، د POI د نژدیوالي مارکرونو د بیا جوړولو لپاره ستراتیژیانې ناڅاپه پاتې دي.دلته، موږ یو پلیټ فارم وړاندې کوو چې د فوتو اکټیویشن انحصاري لیبلینګ (PDPL) په نوم یادیږي، چیرې چې موږ نیلي رڼا کاروو ترڅو د POIs روښانه کولو لپاره د miniSOG فوتوسینسایټزر سره یو ځای شوي او د اکسيجن اکسیجن تولید محرک کړو ترڅو د نږدې پاتې شونو اکسیډیز کولو لپاره، د کیمیاوي تحقیقاتو د اکسیډیز کولو لپاره د امین لرونکي تعدیلات تعقیب کړي. منځني ژوندي حجرې..موږ د کیمیاوي تحقیقاتو یوه ډله ازموینه وکړه ترڅو د ټاګ ځانګړتیا اعظمي کړي او د خلاص پروټومکس کاري فلو په کارولو سره د تعدیل ځایونه پیژندلي.د TurboID سره د PDPL یو په بل پسې پرتله کول د PDPL ډیر مشخص او هراړخیز پروټومیک پوښښ ښیې.موږ دا طریقه د فرعي سیلولر پروټوم د عضوي ځانګړي مارکرونو او د سرطان پورې تړلي ایپیګینیټیک تنظیمي پروټین BRD4 او د پارکینسن ناروغۍ پورې اړوند E3 لیګیس پارکین لپاره د پابند شریکانو عمومي پروټوم پیژندنې لپاره پلي کړه ، کوم چې د پروټین پیژندل شوي او نامعلومه شبکه دواړه تاییدوي. تعاملات.د PDPL وړتیا په لوی پروټین کمپلیکسونو کې د E3 سبسټریټ پیژندلو لپاره د داسې حالت استازیتوب کوي چیرې چې د غیر مستقیم باندونو پیژندل اړین دي.دوه نامعلوم پارکین سبسټریټونه چې د ubiquitination-proteasome لخوا منځګړیتوب شوي په وضعیت کې تایید شوي.
فوتوډینامیک درملنه (PDT) 19 او د کروموفور په مرسته لیزر غیر فعال کول (CALI) 20، په کوم کې چې د فوټوسینسایټزر سره د رڼا وړانګې واحد اکسیجن تولیدوي، کولی شي هدف پروټینونه غیر فعال کړي یا د حجرو د مړینې لامل شي.څرنګه چې واحد اکسیجن یو ډیر عکس العمل لرونکی ماده ده چې شاوخوا 70 nm نظریاتي خپریدو فاصله لري ، نو د فوټوسینټیزر شاوخوا ځایی محدود اکسیډریشن کنټرول کیدی شي.د دې مفکورې پراساس، موږ پریکړه وکړه چې د واحد اکسیجن څخه کار واخلو ترڅو په ژوندیو حجرو کې د پروټین کمپلیکس نږدې لیبل ترلاسه کړو.موږ د څلورو دندو د ترسره کولو لپاره د PDPL کیموپروټیومیک طریقه رامینځته کړې: (1) د PL انزیماتیک طریقې ته ورته د فعال واحد اکسیجن تولید کول؛(2) د رڼا په پیل کې د وخت حل شوي لیبلینګ چمتو کړئ؛(3) د بدلون په واسطه (4) د شالید کمولو لپاره د انډروجینس کوفکتورونو (لکه بایوټین) کارولو څخه ډډه وکړئ، یا د چاپیریال فشار سره د حجرو د تماس کمولو لپاره خورا پیچلي خارجي ریجنټ (لکه پیرو اکسایډ) وکاروئ.
Photosensitizers په دوه کټګوریو ویشل کیدی شي پشمول د کوچني مالیکولر وزن فلوروفورس (د بیلګې په توګه ګلاب بنګل، میتیلین نیلي) 22 او په جینیکي ډول کوډ شوي کوچني پروټینونه (د بیلګې په توګه miniSOG، KillerRed) 23.د ماډلر ډیزاین د لاسته راوړلو لپاره، موږ د لومړي نسل PDPL پلیټ فارم جوړ کړ چې د فوتو سینټیزر (PS) پروټینونه په POI24,25 (شکل 1a) کې اضافه کړي.کله چې د نیلي ر lightا سره شعاع کیږي ، واحد اکسیجن د پروکسیمل نیوکلیوفلیک امینو اسید پاتې شونو اکسیډیز کوي ، چې په پایله کې یو امپولنګ قطبیت رامینځته کیږي چې الیکٹروفیلیک دی او کولی شي نور د امین پروب نیوکلیوفیلس 16,17 سره عکس العمل وکړي.پروب د الکین هینډل سره ډیزاین شوی ترڅو د کلک کیمیا اجازه ورکړي او د LC/MS/MS ځانګړتیا لپاره ښکته شي.
د پروټین کمپلیکسونو لیبل کولو سکیمیک مثال چې د miniSOG لخوا منځګړیتوب شوی.کله چې د نیلي رڼا سره مخ کیږي، حجرې چې د miniSOG-POI څرګندونه کوي واحد اکسیجن تولیدوي، کوم چې متقابل پروټینونه بدلوي مګر غیر پابند پروټین نه.د فوتو آکسایډیشن منځګړیتوب محصولات د امین کیمیاوي تحقیقاتو د ریل لیبلونو په واسطه مداخله کیږي ترڅو covalent addducts جوړ کړي.د کیمیا په تحقیقاتو کې د الکینیل ګروپ کلک کیمیا ته اجازه ورکوي چې د LC-MS/MS کمیت په واسطه د پلټ-ډاون په واسطه غني شي.ب د امین پروبونو کیمیاوي جوړښت 1-4.c د مایټوکونډریل محلي شوي miniSOG - منځګړیتوب پروټومیک مارکرونو نمایندګي فلوروسینټ جیل تحلیل د 1-4 پروبونو په کارولو سره او د جیل کثافت میټري پراساس نسبي مقدار.د کیمیاوي تحقیقاتو سیګنال څخه تر شالید تناسب د منفي کنټرول تجربو په کارولو سره ارزول شوی چې د نیلي ر lightا پرته یا د HEK293T حجرو په کارولو سره د miniSOG بیان پرته.n = 2 بیولوژیکي خپلواکه نمونې.هر ټکی د بیولوژیکي نقل استازیتوب کوي.d د PDPL نمایندګي کشف او اندازه کول د غوره شوي تحقیقات 3 په کارولو سره د PDPL اجزاو په شتون یا نشتوالي کې لکه c.n = 3 بیولوژیکي خپلواکه نمونه.هر ټکی د بیولوژیکي نقل استازیتوب کوي.مرکزي کرښې او ویسکرز د اوسط او ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.CBB: Coomassie Briliant Blue.د لرې سور سی-DMA داغ سره د واحد اکسیجن کنفوکل عکس العمل.د پیمانه بار: 10 µm.د جیل امیجنگ او کنفوکال تجربې په خپلواکه توګه لږترلږه دوه ځله د ورته پایلو سره تکرار شوي.
موږ لومړی د بالغ فوټوسینسایټزر miniSOG26 او KillerRed23 وړتیا ازموینه وکړه، چې په HEK293T کې په ثابت ډول څرګند شوي، ترڅو د کیمیاوي تحقیقاتو په توګه د پروټوم پروپارګیلامین لیبل کولو منځګړیتوب وکړي (اضافی شکل 1a).د جیل فلوروسینس تحلیل وښودله چې د پروټووم بشپړ لیبل کول د miniSOG او نیلي ر lightا شعاع په کارولو سره ترلاسه شوي ، پداسې حال کې چې د KillerRed سره د لیبل کولو هیڅ لیبل محصول نه لیدل شوی.د سیګنال څخه تر شالید تناسب ته وده ورکولو لپاره ، موږ بیا د کیمیاوي تحقیقاتو سیټ ازموینه وکړه چې پکې انیلین (1 او 3) ، پروپیلامین (2) ، یا بینزیلامین (4).موږ ولیدل چې د HEK293T حجرې پخپله د هیڅ نیلي ر lightا په پرتله د لوړ شالید سیګنال درلود ، ممکن د اینڈوجینس ریبوفلاوین فوتوسینسایټزر ، فلاوین مونونوکلیوټایډ (FMN) 27 له امله. د انیلین پر بنسټ کیمیاوي تحقیقات 1 او 3 ښه ځانګړتیا لري، د HEK293T په ثابت ډول په مایتوکونډریا کې د miniSOG څرګندونه کوي د 3 لپاره د سیګنال> 8 چنده زیاتوالی ښیې، پداسې حال کې چې تحقیقات 2 د RNA لیبل کولو میتود CAP-seq کې کارول کیږي یوازې ~ 2.5- ښیې. د فولډ سیګنال زیاتوالی، احتمال د RNA او پروټین ترمنځ د مختلف غبرګون غوره توبونو له امله (انځور 1b، c). د انیلین پر بنسټ کیمیاوي تحقیقات 1 او 3 ښه ځانګړتیا لري، د HEK293T په ثابت ډول په مایتوکونډریا کې د miniSOG څرګندونه کوي د 3 لپاره د سیګنال> 8 چنده زیاتوالی ښیې، پداسې حال کې چې تحقیقات 2 د RNA لیبل کولو میتود CAP-seq کې کارول کیږي یوازې ~ 2.5- ښیې. د فولډ سیګنال زیاتوالی، احتمال د RNA او پروټین ترمنځ د مختلف غبرګون غوره توبونو له امله (انځور 1b، c).د انیلین پر بنسټ کیمیاوي تحقیقات 1 او 3 غوره ځانګړتیا ښودلې: HEK293T، کوم چې په ثابت ډول په مایتوکونډریا کې miniSOG څرګندوي، د 3 تحقیقاتو لپاره په سیګنال کې له 8 څخه ډیر زیاتوالی ښیي، پداسې حال کې چې د تحقیقاتو 2، د CAP-seq RNA لیبل کولو میتود کې کارول کیږي، یوازې د سیګنال ~ 2.5 چنده زیاتوالی ښیې، شاید د RNA او پروټین ترمنځ د مختلف عکس العمل غوره توبونو له امله (انځور 1b، c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-倍信号增加,可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b،c.基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 - 倍信号增加,可能是由于RNAد انیلین پر بنسټ کیمیاوي تحقیقات 1 او 3 ښه ځانګړتیا درلوده، HEK293T په ثابت ډول په میتوکونډریا کې miniSOG څرګند کړ، او تحقیقات 3 په سیګنال کې له 8 څخه ډیر زیاتوالی درلود، په داسې حال کې چې د CAP-seq RNA لیبل کولو میتود لپاره 2 تحقیقات یوازې ~ 2.5 - چنده زیاتوالی ښودلی.په سیګنال کې، شاید د RNA او پروټین ترمنځ د مختلف غبرګون غوره توبونو له امله (انځور 1b، c).برسېره پردې، د تحقیقاتو 3 isomers او د هایدرازین تحقیقات (5، 6، 7 تحقیقات) ازمول شوي، د 3 تحقیقاتو اصلاح کول تاییدوي (اضافی شکل. 1b،c).په ورته ډول، د جیل فلوروسینس تحلیل نور مطلوب تجربه لرونکي پیرامیټونه په ډاګه کړل: د شعاع طول موج (460 nm)، د کیمیاوي تحقیقاتو غلظت (1 mM)، او د شعاع وخت (20 دقیقې) (اضافی شکل 2a–c).د PDPL پروتوکول کې د هرې برخې یا ګام لرې کول د پام وړ سیګنال شالید ته د بدلون لامل شوی (انځور 1d).د پام وړ، د پروټین لیبل کول د سوډیم ایزایډ یا ټراوکس په شتون کې د پام وړ کم شوي، کوم چې د واحد اکسیجن قوی کولو لپاره پیژندل کیږي.د D2O شتون، کوم چې د واحد اکسیجن ثبات لپاره پیژندل کیږي، د لیبل کولو سیګنال ته وده ورکوي.د لیبل کولو لپاره د نورو عکس العمل اکسیجن ډولونو د ونډې تحقیق کولو لپاره ، مانیټول او ویټامین سي په ترتیب سره د هایدروکسیل او سوپر اکسایډ رادیکال سکینجرونو رامینځته کولو لپاره اضافه شوي ، 18, 29 ، مګر دوی د لیبل کولو کمولو لپاره ونه موندل شول.د H2O2 اضافه کول، مګر روښانتیا نه، د لیبل کولو نتیجه نه وه (اضافی شکل. 3a).د Si-DMA پروبونو سره د فلوروسینس واحد اکسیجن امیجنگ د HEK293T-miniSOG تار کې د واحد اکسیجن شتون تایید کړ، مګر په اصلي HEK293T تار کې نه.برسېره پردې، mitoSOX Red نشي کولی د روښانتیا وروسته د سوپر اکسایډ تولید کشف کړي (انځور 1e او ضمیمه انځور. 3b) 30. دا معلومات په کلکه وړاندیز کوي چې واحد اکسیجن اصلي غبرګوني اکسیجن ډولونه دي چې د پروټومیک لیبل کولو لپاره مسؤل دي.د PDPL سایټوټوکسیت د نیلي ر lightا شعاع او کیمیاوي تحقیقاتو په شمول ارزول شوی و ، او کوم مهم سایټوټوکسیت نه و لیدل شوی (اضافی شکل 4a).
د دې لپاره چې د لیبل کولو میکانیزم مطالعه کړو او د LC-MS/MS په کارولو سره د پروټین کمپلیکسونو پروټومیک پیژندنه فعاله کړو، موږ لومړی باید دا معلومه کړو چې کوم امینو اسیدونه تعدیل شوي او د پروب لیبلونو ډیلټا ډله.Methionine، histidine، Tryptophan او tyrosine راپور شوي چې د واحد اکسیجن 14,15 لخوا تعدیل شوي.موږ د TOP-ABPP31 کاري فلو د MSFragger32 پراساس د FragPipe کمپیوټري پلیټ فارم لخوا چمتو شوي بې طرفه خلاص لټون سره مدغم کوو.د واحد اکسیجن ترمیم او د کیمیاوي تحقیقاتو لیبل کولو وروسته، کلک کیمیا د بایوټین کمولو لیبل په کارولو سره ترسره شو چې د کلیو وړ لینکر لري، وروسته د نیوتراویډین سټرچنګ او ټریپسین هضم.تعدیل شوی پیپټایډ، چې لا هم په رال پورې تړلی و، د LC-MS/MS تحلیل لپاره عکس العمل شوی و (شکل 2a او ضمیمه ډاټا 1).د پروټوم په اوږدو کې د 50 پیپټایډ نقشې (PSM) میچونو لیست شوي (انځور 2b) سره لوی شمیر بدلونونه رامینځته شوي.په حیرانتیا سره، موږ یوازې د هسټیډین تعدیل لیدلی، شاید د نورو امینو اسیدونو په پرتله د انیلین پروبونو په لور د اکسایډ شوي هسټیډین د لوړ تعامل له امله.د واحد اکسیجن په واسطه د هسټیډین اکسیډیشن د خپاره شوي میکانیزم له مخې، 21,33 د +229 Da وړاندیز شوی ډیلټا ماس جوړښت د دوه اکسیډیشنونو وروسته د 2-oxo-histidine سره د پروب 3 اضافه کولو سره مطابقت لري، پداسې حال کې چې +247 Da د هایدرولیس محصول دی. د +229 دا (اضافی شکل. 5).د MS2 سپیکٹرم ارزونې د ډیری y او b آئنونو د پیژندلو لوړ اعتبار ښودلی، پشمول د تعدیل شوي ټوټه ایونونو (y او b) پیژندنه (انځور 2c).د PDPL- تعدیل شوي هسټیډینونو د محلي ترتیب تحلیل د ±1 پوستونو کې د کوچني هایدروفوبیک پاتې شونو لپاره د منځني شکل غوره توب څرګند کړ (اضافی شکل. 4b).په اوسط ډول، په هر پروټین کې 1.4 هسټیډین پیژندل شوي، او د دې مارکرونو ځایونه د محلول د لاسرسي وړ سطحې ساحې (SASA) او د نسبي محلول موجودیت (RSA) تحلیل (اضافی شکل 4c،d) لخوا ټاکل شوي.
د MSFragger لخوا پرمخ وړل شوي FragPipe کمپیوټري پلیټ فارم په کارولو سره د پاتې کیدو انتخاب مطالعې لپاره یو بې طرفه کاري جریان.د پاکولو وړ لینکرونه په کلک کیمیا کې کارول کیږي ترڅو د سټیپټاویډین رال څخه د تعدیل شوي پیپټایډونو عکس العمل اجازه ورکړي.یو خلاص لټون پیل شو ترڅو د ډیری اصالحاتو پیژندلو، او همدارنګه د اړوندو پاتې شونو پیژندلو لپاره.ب په ټول پروټوم کې د بدلونونو ډله ایز ترتیب کړئ.پیپټایډ نقشه PSM.c MS2 د هسټیډین سایټونو سپیکٹرل تشریح د 3 پروب سره تعدیل شوی. د نمایندګۍ مثال په توګه، د 3 پروب سره یو covalent عکس العمل + 229.0938 Da تعدیل شوي امینو اسید ته اضافه کړل.د بدلون ارزونه د PDPL نښه کونکو لپاره ازموینې لپاره کارول کیږي.PRDX3 (H155A, H225A) او PRDX1 (H10A, H81A, H169A) د بیرغ ضد کشف لپاره د وحشي ډوله پلاسمیډونو سره لیږدول شوي.e مصنوعي پیپټایډ د 3 تحقیقاتو په شتون کې د پاک شوي miniSOG سره عکس العمل ښودلی و او اړوند محصولات د Δm +247 او +229 سره په LC-MS سپیکٹرم کې یادونه شوي.f د ویټرو پروټین څخه تر پروټین متقابل عمل د miniSOG-6xHis-tag او د 6xHis انټي باډي سره ماډل شوی.انټي بیوټین (سټریپټاویډین-HRP) او د موږک ضد غربي بلاټ تحلیل د miniSOG-6xHis/Anti-6xHis انټي باډي کمپلیکسونه چې د پروب 3 سره لیبل شوي ، د ر lightا سره د تماس وخت پورې اړه لري.د انفرادي پروټینونو لیبلونه په ورته مالیکولر وزن کې څرګند شوي: د LC انټي باډي ر lightا زنځیر ، د HC انټي باډي درانه سلسله.دا تجربې په خپلواکه توګه لږترلږه دوه ځله د ورته پایلو سره تکرار شوي.
د لیبل کولو سایټ د بایو کیمیکل تصدیق لپاره، PRDX3 او PRDX1 د ډله ایز سپیکرومیټري لخوا پیژندل شوي د هسټیډین څخه الانین ته بدل شوي او د لیږد په ارزونو کې د وحشي ډول سره پرتله شوي.د PDPL پایلو وښودله چې بدلون د پام وړ لیبلینګ کم کړی (انځور 2d).په ورته وخت کې، په خلاص لټون کې پیژندل شوي پیپټایډ سلسلې ترکیب شوي او په ویټرو کې د پاک شوي miniSOG سره د تحقیقاتو 3 او نیلي ر lightا په شتون کې عکس العمل ښودل شوی ، د LC-MS لخوا کشف شوي د +247 او +229 Da ډله ایز بدلون سره محصولات ترلاسه کوي (انځور . 2e).).د دې ازموینې لپاره چې ایا متقابل پروکسیمل پروټینونه د miniSOG عکس العمل په ځواب کې په ویټرو کې لیبل کیدی شي ، موږ د miniSOG-6xHis پروټین او په ویټرو کې د هغه ضد مونوکلونل انټي باډي تر مینځ د متقابل عمل له لارې مصنوعي قربت ارزونه ډیزاین کړې (شکل 2f).پدې ارزونه کې ، موږ د miniSOG سره د انټي باډي درنو او سپک زنځیرونو نږدې لیبل کولو تمه درلوده.په حقیقت کې، د موږک ضد (د 6xHis-لیبل ضد انټي باډي د درنو او سپکو زنځیرونو پیژندل) او streptavidin لویدیځ بلاټونه د درنو او سپکو زنځیرونو قوي بایوټینیلیشن ښودلی.د پام وړ، موږ د 6xHis ټیګ او د سپکو او درنو زنځیرونو ترمنځ کراس لینکونو له امله د miniSOG آټوبیوټینیلیشن لیدلی، کوم چې ممکن د لیسین او 2-oxo-histidine proximal غبرګون تر مینځ مخکې تشریح شوي تشې سره تړاو ولري.په پایله کې، موږ دې نتیجې ته ورسیدو چې PDPL په نږدې پورې تړلي ډول هسټیډین بدلوي.
زموږ راتلونکی هدف د فرعي سیلولر پروټوم ځانګړتیا وه ترڅو د وضعیت لیبل کولو ځانګړتیا ازموینه وکړي.له همدې امله، موږ په ثابت ډول د HEK293T حجرو (انځور 3a) په نیوکلیوس، مایتوکونډریال میټرکس، یا د ER خارجي ER جھلی کې miniSOG څرګند کړ.د جیل فلوروسینس تحلیل په دریو فرعي سیلولر ځایونو کې په پراخه کچه لیبل شوي بډونه او همدارنګه د مختلف لیبل کولو نمونې (انځور 3b) په ګوته کړې.د فلوروسینس امیجنگ تحلیل د PDPL لوړ ځانګړتیا ښودلې (انځور 3c).د PDPL کاري جریان د فلوروسینس مایکروسکوپي په کارولو سره د فرعي سیلولر پروټومونو توضیح کولو لپاره د روډامین رنګونو سره د کلک عکس العملونو سره تعقیب شو ، او د PDPL سیګنالونه د DAPI ، مایټوکونډریل ټریکرونو ، یا ER ټریکرونو سره یوځای شوي ، چې د PDPL لوړه وفاداري تاییدوي.د درې ارګانیل موقعیتونو لپاره، د avidin لویدیځ بلاټ په کارولو سره د TurboID سره د PDPL سره په څنګ کې پرتله کول وښودله چې PDPL د دوی اړوند کنټرولونو په پرتله په ځانګړي ډول لیبل شوی.د PDPL شرایطو لاندې، ډیر لیبل شوي بانډونه ښکاره شوي، چې د PDPL لیبل شوي پروټینونه په ګوته کوي (اضافی شکل. 6a-d).
د miniSOG - منځګړیتوب ارګانیل ځانګړي پروټوم لیبل کولو سکیمیک نمایش.miniSOG د فیوژن له لارې mitochondrial matrix د انسان COX4 (mito-miniSOG) د N-ټرمینل 23 امینو اسیدونو (mito-miniSOG)، نیوکلیوس د فیوژن له لارې H2B (نیوکلیوس-miniSOG) ته، او Sec61β د ER جھلی د سایتوپلاسمیک اړخ (ER-miniSOG) له لارې په نښه کوي. ).په اشارو کې د جیل امیجنگ، کنفوکل امیجنگ، او ډله ایز سپیکرومیټري شامل دي.b د درې ارګانیل ځانګړي PDPL پروفایلونو نمایندګي جیل عکسونه.CBB Coomassie بریلینټ بلیو.c د HEK293T حجرو نمایندګي کنفوکل عکسونه په ثابت ډول miniSOG څرګندوي د مختلف فرعي سیلولر ځایی کولو سره د انټي باډي لیبل V5 (سرخ) لخوا کشف شوي.فرعي سیلولر مارکرونه د مایټوکونډریا او ER (شنه) لپاره کارول کیږي.د PDPL کاري فلو کې د Cy3-azide کلک کیمیا په کارولو سره د miniSOG (ژیړ) لیبل شوي فرعي سیلولر پروټومونو کشف کول شامل دي.د پیمانه بار: 10 µm.d د PDPL-ټاګ شوي پروټومونو آتش فشاني پلاټ په مختلفو ارګانونو کې د غیر لیبل شوي مقدار (n = 3 خپلواک بیولوژیکي تجربو) لخوا اندازه شوي.د دوه لکۍ زده کونکي ټي ټیسټ په آتش فشانو پلاټونو کې کارول شوی و.HEK293T وحشي ډول د منفي کنټرول په توګه کارول شوی و. د پام وړ بدل شوي پروټینونه په سور کې روښانه شوي (p <0.05 او> 2-fold د آئن شدت توپیر). د پام وړ بدل شوي پروټینونه په سور کې روښانه شوي (p <0.05 او> 2-fold د آئن شدت توپیر). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). د پام وړ بدل شوي پروټینونه په سور رنګ کې روښانه شوي (p <0.05 او> د آئن شدت کې 2-fold توپیر).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和>2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). د پام وړ بدل شوي پروټینونه په سور رنګ کې روښانه شوي (p <0.05 او> په ionic ځواک کې 2-fold توپیر).اړوند پروټینونه د HEK293T-miniSOG لپاره مهم دي مګر د HEK293T لپاره مهم ندي په شنه کې ښودل شوي.د تجربو څخه د پروټومیک ډیټاسیټونو ځانګړتیا تحلیل d.په هر ارګانیل کې د احصایوي پلوه د پام وړ پروټینونو مجموعه (سور او شنه نقطې) په سر کې نښه شوې.هسټوګرامونه د MitoCarta 3.0، GO شننې او A. Ting et al پر بنسټ په ارګانیلونو کې ځایی شوي پروټینونه ښیې.خلکد مایتوکونډریا، نیوکلی او ER لپاره جلا ډیټاسیټونه.دا تجربې په خپلواکه توګه لږترلږه دوه ځله د ورته پایلو سره تکرار شوي.خام ډاټا د خام ډیټا فایلونو په بڼه چمتو شوي.
د جیل او امیجنگ پایلو لخوا هڅول شوي، د لیبل څخه پاک مقدار کول په هر ارګانیل کې د پیژندل شوي پروټوم اندازه کولو لپاره کارول شوي (اضافي ډاټا 2).غیر انتقال شوی HEK293T د شالید مارکرونو کمولو لپاره د منفي کنټرول په توګه کارول شوی و. د آتش فشاني پلاټ تحلیل د پام وړ بډایه شوي پروټینونه ښودلي (p <0.05 او> 2-fold ion intensity) او همدارنګه د سنگلټون پروټینونه چې یوازې د miniSOG څرګندونکي لینونو کې شتون لري (انځور. 3d سور او شنه نقطې). د آتش فشاني پلاټ تحلیل د پام وړ بډایه شوي پروټینونه ښودلي (p <0.05 او> 2-fold ion intensity) او همدارنګه د سنگلټون پروټینونه چې یوازې د miniSOG څرګندونکي لینونو کې شتون لري (انځور. 3d سور او شنه نقطې). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). د آتش فشاني پلاټ تحلیل د پام وړ بډایه شوي پروټینونه (p<0.05 او> 2-fold ion intensity) او همدارنګه یو واحد پروټینونه چې یوازې د miniSOG څرګندونکي لینونو کې شتون لري ښودل شوي (انځور. 3d، سور او شنه نقطې).火山图火山图 显示显示 显着 显着 富集 富集 蛋白质 (p <0.05 和 和 和 和 和 和 和 和 和 强度 强度 存 存 存 在于 minds grisg 表达 系 中 中 中 的 蛋白质 (图 3D 蛋白质).火山图火山图 显示显示 出 显着 的 蛋白质 (P <0.05 和 和 和 和> 2 在于 Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). د آتش فشاني پلاټ تحلیل د پام وړ بډایه شوي پروټینونه (p <0.05 او> 2x ionic ځواک) او همدارنګه یو واحد پروټینونه چې یوازې د miniSOG څرګندونې لاین کې شتون لري (په شکل 3d کې سور او شنه نقطې) په ګوته کړي.د دې معلوماتو په یوځای کولو سره، موږ په ترتیب سره 1364، 461، او 911 د احصایې له پلوه د پام وړ اټومي، مایټوکونډریال، او د ER خارجي غشا پروټینونه پیژندلي.د Organelle-localized PDPL د دقت تحلیل کولو لپاره، موږ MitoCarta 3.0، د جین اونټولوژي (GO) تحلیل، او A. Ting et al.د ډیټا سیټ 8 د مایتوکونډریا، نیوکلیوس او ER لپاره کارول شوی ترڅو د کشف شوي پروټینونو ارګانیل ځانګړتیا ازموینه وکړي، د 73.4، 78.5، او 73.0٪ دقت سره مطابقت لري (انځور 3e).د PDPL ځانګړتیا دا تاییدوي چې PDPL د ارګانیل ځانګړي پروټومونو پیژندلو لپاره یو غوره وسیله ده.د پام وړ، د پیژندل شوي مایټوکونډریال پروټینونو سبوکونډریال تحلیل وښودله چې ګیر شوي پروټوم په عمده توګه په میټریکس او داخلي غشا (226 او 106، په ترتیب سره) ویشل شوي، د پیژندل شوي مایټوکونډریال پروټینونو ټول شمیر 91.7٪ (362) حساب کوي.د PDPL لوړه کچه هم تایید شوې (اضافی شکل. 7a).په ورته ډول، د فرعي نیوکلیر تحلیل وښودله چې نیول شوي پروټوم په عمده توګه په نیوکلیوس، نیوکلیوپلاسم، او نیوکلیولس (اضافی شکل 7b) کې ویشل شوي.د اټومي محلي کولو سیګنال پیپټایډ (3xNLS) سره اټومي پروټومیک تحلیل د H2B ساختمان ته ورته دقت وښود (اضافی شکل. 7c–h).د PDPL مارکر ځانګړتیا معلومولو لپاره، اټومي لامینین A د یو ډیر جلا ځایی شوي POI7 جال په توګه غوره شوی.PDPL 36 د پام وړ بډایه شوي پروټینونه پیژندلي، چې له دې جملې څخه 12 پروټینونه (30.0٪ د لامین A په شمول) د لامین A سره متقابل پروټینونه چې د سټینګ ډیټابیس لخوا تشریح شوي ښه ځانګړتیا لري، د BioID میتود (122 پروټینونو) څخه د 28 څخه د 28، 22.9 په پرتله لوړه سلنه لري. ٪) 7. زموږ میتود لږ پروټینونه پیژندلي، ممکن د محدود لیبل کولو ساحو له امله، چې د ډیرو فعال واحد اکسیجن لخوا ممکن شوي.د GO تحلیل وښودله چې پیژندل شوي پروټینونه په عمده توګه په نیوکلیوپلازم (26)، اټومي غشا (10)، اټومي غشا (9)، او اټومي پورز (5) کې موقعیت لري.په ټولیز ډول، دا اټومي محلي پروټینونه د بډایه شوي پروټینونو 80٪ حسابوي، چې د PDPL ځانګړتیا نوره هم څرګندوي (اضافی شکل. 8a-d).
په ارګانیلز کې د نږدې نښه کولو لپاره د PDPL وړتیا رامینځته کولو سره ، موږ بیا ازموینه وکړه چې ایا PDPL د POI پابند شریکانو تحلیل کولو لپاره کارول کیدی شي.په ځانګړې توګه، موږ هڅه وکړه چې د سایټوسولیک پروټینونو PDPL تحلیل تعریف کړو، کوم چې د دوی د خورا متحرک طبیعت له امله د دوی د غشا - محلي همکارانو په پرتله خورا ستونزمن هدفونه ګڼل کیږي.د bromodomain او extraterminal (BET) پروټین BRD4 په مختلفو ناروغیو 35, 36 کې د خپل کلیدي رول لپاره زموږ پاملرنه راجلب کړې.هغه کمپلکس چې د BRD4 لخوا رامینځته شوی د لیږد کوونکی او یو مهم معالجوي هدف دی.د c-myc او Wnt5a ټرانسکرپشن فکتورونو څرګندولو تنظیم کولو سره، BRD4 د حاد مایلایډ لیوکیمیا (AML)، څو مایلوما، بورکیټ لیمفوما، د کولمو سرطان او التهابي ناروغیو 37,38 کلیدي ټاکونکی ګڼل کیږي.برسېره پردې، ځینې ویروسونه BRD4 په نښه کوي ترڅو د ویروس او سیلولر لیږد تنظیم کړي، لکه پیپیلوما ویروس، HIV، او SARS-CoV-236,39.
د PDPL په کارولو سره د BRD4 تعامل نقشه کولو لپاره، موږ miniSOG د BRD4 لنډ N- یا C-ټرمینل isoform سره یوځای کړ.د پروټومیک پایلو د دوو ساختمانونو تر منځ د لوړې درجې تفاوت څرګند کړ (اضافی شکل. 9a).اټومي پروټوم د miniSOG-H2B سره پیژندل شوی 77.6٪ پروټینونه پوښي چې د BRD4 سره تعامل کوي (اضافی شکل. 9b).بیا، د روښانتیا مختلف وختونه (2، 5، 10، 20 دقیقې) د مارکر وړانګو د تنظیم کولو لپاره کارول شوي (انځور 4a او اضافي معلومات 3).موږ دې نتیجې ته ورسیدو چې په لنډو فوټوپیریوډونو کې، PDPL به په ابتدايي توګه مستقیم پابند شریکان لیبل کړي، پداسې حال کې چې اوږدې مودې کې به پروټینونه شامل وي چې د لنډ عکس العمل دورې په جریان کې پیژندل شوي او همدارنګه د لیبل کولو کمپلیکسونو کې غیر مستقیم هدفونه.په حقیقت کې، موږ د نږدې وخت نقطو ترمنځ قوي اوورلیپ وموندلو (84.6٪ د 2 او 5 دقیقو لپاره؛ 87.7٪ د 5 او 10 دقیقو لپاره؛ 98.7٪ د 10 او 20 دقیقو لپاره) (انځور 4b او اضافي شکل. 9c).په ټولو تجربوي ګروپونو کې، موږ نه یوازې د BRD4 ځان لیبل کول موندلي، بلکې ډیری پیژندل شوي هدفونه لکه MED1، CHD8، BICRA، NIPBL، SMC1A، او HMGB1 د سټینګ ډیټابیس کې تشریح شوي.د دې هدفونو ionic ځواک د افشا کولو وخت سره متناسب دی (انځور 4c او اضافي شکل. 9d).په 2 دقیقو ګروپ کې د پیژندل شوي پروټینونو GO تحلیل وښودله چې پیژندل شوي پروټینونه په نیوکلیوس کې ځایی شوي او د کروماتین ریموډیلینګ او RNA پولیمریز فعالیت کې ښکیل وو.د پروټین مالیکولر فعالیت د کروماتین پابند یا ټرانسکریپشن کوایکټیوشن کې بډایه شوی ، د BRD4 فعالیت سره مطابقت لري (انځور 4d).د سټینګ ډیټابیس فعال شوي پروټین تعامل تحلیل د BRD4 او HDAC کورنۍ متقابل عمل کولو کمپلیکسونو لکه SIN3A, NCOR2, BCOR, او SAP130 (انځور 4e او اضافي شکل 9e) ترمینځ د غیر مستقیم متقابل عمل لومړۍ کچه څرګنده کړه, د BRD4 او HDAC پابندۍ سره مطابقت لري. ..برسېره پردې، د LC-MS/MS لخوا پیژندل شوي نمایشي هدفونه، پشمول د Sin3A، NSUN2، Fus، او SFPQ، د لویدیځ بلاټینګ لخوا تایید شوي (Fig. 4f).په دې وروستیو کې، د BRD4 لنډ isoform راپور شوی چې د مایع - مایع پړاو جلا کولو (LLPS) ملکیتونو سره نیوکلی جوړوي.د RNA پابند پروټینونه Fus او SFPQ د مختلفو سیلولر پروسو LLPS منځګړیتوب کوي او دلته د غیر ثبت شوي BRD4 پابند پروټینونو په توګه پیژندل شوي.د BRD4 او SFPQ ترمنځ متقابل عمل د ګډ معافیت (co-IP) تجربو (شکل 4g) لخوا تایید شوی، چې د BRD4 منځګړیتوب د مایع - مایع پړاو جلا کولو لپاره بل میکانیزم وړاندیز کوي چې د نورو تحقیقاتو مستحق دي.یوځای اخیستل شوي، دا پایلې وړاندیز کوي چې PDPL د پیژندل شوي BRD4 متقابل عمل او همدارنګه د نامعلوم پابند پروټینونو پیژندلو لپاره یو مثالی پلیټ فارم دی.
د miniSOG منځګړیتوب شوي BRD4 د نږدي نښه کولو سکیمیک نمایش، د افشا کولو وختونه: 2، 5، 10، او 20 دقیقې.b په مختلفو روښانتیا وختونو کې پیژندل شوي پروتینونو سره یوځای شوي.د پروټین غني کول په HEK293T-miniSOG-BRD4 کې پیژندل شوي د وحشي ډول HEK293T په پرتله د احصایې له پلوه د پام وړ و.c د ایون شدت کله چې د ټاکل شوي وخت په جریان کې د لیبل شوي نمایندګۍ پیژندل شوي BRD4- پابند پروټینونو اندازه کول.n = 3 بیولوژیکي خپلواکه نمونه.ډاټا د اوسط ± معیاري انحراف په توګه وړاندې کیږي.د 2 دقیقو ګروپ کې پیژندل شوي پروټینونو جین انټوولوژیکي تحلیل (GO).د لومړي لس GO شرایط لیست شوي دي.بلبلونه د GO اصطلاح کټګورۍ سره سم رنګ شوي، او د بلبل اندازه په هره اصطلاح کې موندل شوي پروټینونو شمیر سره متناسب ده.د BRD4 سره د متقابل عمل پروټینونو د تار تحلیل.ژېړ حلقې مستقيم ګونګ دي او خړ حلقې د غير مستقيم ګلو لومړۍ طبقه ده.سور کرښې د تجربوي تعاملاتو استازیتوب کوي او نیلي کرښې د وړاندوینې تعاملاتو استازیتوب کوي.f په LC-MS/MS کې د BRD4 نمایندګي ټاکل شوي هدفونه د لویدیځ بلاټینګ لخوا تایید شوي.g د ګډ معافیت تجربې د SFPQ او BRD4 ترمنځ تعامل تاییدوي.دا تجربې په خپلواکه توګه لږترلږه دوه ځله د ورته پایلو سره تکرار شوي.خام ډاټا د خام ډیټا فایلونو په بڼه چمتو شوي.
د غیر راجستر شوي POI پورې تړلي اهدافو پیژندلو سربیره، موږ فرض کوو چې PDPL به د انزایمونو لپاره د فرعي سټیټونو پیژندلو لپاره مناسب وي، کوم چې به په لویو کمپلکسونو کې د غیر مستقیم پابند پروټینونو ځانګړتیا ته اړتیا ولري ترڅو غیر راجستر شوي سبسټریټ تشریح کړي.پارکین (د PARK2 لخوا کوډ شوی) یو E3 ligase دی او په پارکین کې بدلونونه پیژندل شوي چې د آٹوسومل ریسیسیو ځوان پارکینسن ناروغۍ (AR-JP) 42 لامل کیږي.برسېره پر دې، پارکین د مایتوفاګي (mitochondrial autophagy) او د عکس العمل اکسیجن ډولونو له مینځه وړلو لپاره اړین بلل شوی.په هرصورت، که څه هم د پارکین ډیری فرعي عناصر پیژندل شوي، په دې ناروغۍ کې د پارکین رول ناڅرګند پاتې دی.د دې غیر مشخص شوي سبسټریټ تشریح کولو لپاره ، PDPL د پارکین N- یا C-ټرمینس کې د miniSOG اضافه کولو سره ازمول شوی و.حجرې د کاربونیل سیانایډ پروټون ټرانسپورټر m-chlorophenylhydrazone (CCCP) سره درملنه شوې ترڅو د PINK1 - پارکین لارې له لارې پارکین فعال کړي.زموږ د BRD4 PDPL پایلو په پرتله، د پارکین این ټرمینس فیوژن د هدف پروټینونو لوی سیټ څرګند کړ، که څه هم دا د C-ټرمینس لویه برخه پوښلې (د 210 څخه 177) (شکل 5a،b او اضافي معلومات 4).پایله د راپورونو سره مطابقت لري چې د N-ټرمینل ټاګونه کولی شي په ناڅاپي ډول Parkin44 فعال کړي.په حیرانتیا سره، د پارکین 43 لپاره د AP-MS خپاره شوي پایلو سره زموږ په معلوماتو کې یوازې 18 متقابل پروټینونه شتون درلود، احتمال د سیل لینونو او پروټومکس کاري فلو ترمنځ توپیرونو له امله.د څلورو پیژندل شویو پروټینونو سربیره (ARDM1، HSPA8، PSMD14، او PSMC3) د دوو میتودونو لخوا پیژندل شوي (انځور 5c) 43.د LC-MS/MS د پایلو د لا تصدیق کولو لپاره، د PDPL درملنه او ورپسې لویدیځ بلاټینګ د HEK293T د والدینو حجرو د ارزونې پایلې او د ثابت N-ټرمینل پارکین لاین پرتله کولو لپاره کارول شوي.مخکې نامعلوم هدفونه CDK2، DUT، CTBP1، او PSMC4 د پیژندل شوي باندر، DNAJB1 (انځور 5d) سره ازموینه شوي.
د HEK293T حجرو کې د پارکین متقابل پروټینونو آتش فشاني پلاټ چې په ثابت ډول څرګند شوي miniSOG سره د پارکین N- یا C-ټرمینوس سره یوځای شوي (n = 3 خپلواک بیولوژیکي تجربې).د دوه لکۍ زده کونکي ټي ټیسټ په آتش فشانو پلاټونو کې کارول شوی و.HEK293T د منفي کنټرول په توګه کارول کیده. د پام وړ بدل شوي پروټینونه په سور کې روښانه شوي (p <0.05 او> 2-fold د آئن شدت توپیر). د پام وړ بدل شوي پروټینونه په سور کې روښانه شوي (p <0.05 او> 2-fold د آئن شدت توپیر). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). د پام وړ بدل شوي پروټینونه په سور رنګ کې روښانه شوي (p <0.05 او> د آئن شدت کې 2-fold توپیر).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和>2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). د پام وړ بدل شوي پروټینونه په سور رنګ کې روښانه شوي (p <0.05 او> په ionic ځواک کې 2-fold توپیر).اړوند پروټینونه د HEK293T-miniSOG لپاره مهم دي مګر د HEK293T لپاره مهم ندي په شنه کې ښودل شوي.د وین ډیاګرام د N-ټرمینل او C-ټرمینل ساختمانونو تر منځ د پروتینونو د پورته کولو ښکارندوی کوي.د N-ټرمینل ټاګونه کولی شي په ناڅاپي ډول پارکین فعال کړي او د پیژندلو وړ پروټینونو پایله ولري.c د وین ډیاګرام د PDPL او AP-MS تر مینځ متقابل پروټینونه ښیې.پیژندل شوي متقابل عملونه لیست شوي، په شمول د 18 څخه 4 او د 159 پروټینونو څخه 11 په ځانګړي ډول په PDPL کې پیژندل شوي.د LC-MS/MS لخوا پیژندل شوي نمایشي هدفونه د لویدیځ بلاټینګ لخوا تایید شوي.e Ssu72 او SNW1 د غیر راجستر شوي پارکین سبسټریټ په توګه پیژندل شوي.دا د FLAG په نښه شوي پروټین پلاسمیډونه د HEK293T او HEK293T-Parkin-miniSOG ته لیږدول شوي او وروسته د CCCP درملنې په مختلفو وختونو کې.تخریب د پارکین اوور ایکسپریشن لاین کې ډیر څرګند و.f د پروټیزوم انابیټر MG132 په کارولو سره ، دا تایید شوه چې د Ssu72 او SNW1 د تخریب پروسه د پروټیزوم - یوبیکیټینیشن لخوا منځګړیتوب کیږي.دا تجربې په خپلواکه توګه لږترلږه دوه ځله د ورته پایلو سره تکرار شوي.خام ډاټا د خام ډیټا فایلونو په بڼه چمتو شوي.
د پام وړ، هغه پروټینونه چې د PDPL لخوا پیژندل شوي باید د پارکین پابند پروټینونه او د دوی سبسټریټ شامل وي.د پارکین غیر راجستر شوي فرعي سټیټونو موندلو لپاره، موږ اوه پیژندل شوي پروټینونه (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 او SNW1) او انتقال شوي پلاسمایډونه غوره کړل ترڅو دا جینونه نورمال HEK293T ته ښکاره کړي او د miniSOG-Parkin's2CCT3 درملنې لخوا په ثابت ډول څرګند شي.د Ssu72 او SNW1 پروټینونو کچه د miniSOG-پارکین په باثباته کرښه کې د پام وړ کمه شوې وه (انځور 5e).د CCCP سره د 12 ساعتونو لپاره درملنه د دواړو سبسټریټ خورا مهم تخریب پایله وه.د دې لپاره چې د دې تحقیق لپاره چې د Ssu72 او SNW1 تخریب د پروټیزوم - ubiquitination لخوا تنظیم کیږي، د پروټیزوم مخنیوی MG132 د پروټیزوم فعالیت منع کولو لپاره اضافه شوی، او په حقیقت کې موږ وموندل چې د دوی د تخریب پروسه منع شوې وه (انځور 5f).اضافي غیر سبسټریټ هدفونه د پارکین متقابل عمل کونکي په توګه تایید شوي چې د لویدیځ بلاټینګ په کارولو سره (اضافی شکل 10) چې د LC-MS/MS سره ثابت پایلې ښودلې.په پایله کې، د هدف پروټین لیږد تصدیق سره د PDPL کاري فلو ادغام د غیر راجستر شوي E3 ligase substrates پیژندلو ته اجازه ورکوي.
موږ د نږدې نږدې نښه کولو یو عام پلیټ فارم رامینځته کړی چې تاسو ته اجازه درکوي په ځای او وخت کې د POIs متقابل عمل وپیژني.پلیټ فارم د miniSOG فوتوسنسیټیزر پروټین پراساس دی ، کوم چې یوازې 12 kDa دی ، د بالغ APEX2 انزایم (27 kDa) له نیمایي څخه کم او د TurboID (35 kDa) اندازې دریمه برخه.کوچنۍ اندازه باید د کوچني پروټین متقابل عمل مطالعې لپاره د غوښتنلیکونو لړۍ پراخه کړي.د اضافي فوټوسینسایټزر نور سپړنه، که په جینیکي ډول کوډ شوي پروټینونه یا کوچني مالیکولونه وي، د واحد اکسیجن د مقدار حاصل زیاتولو او د دې طریقې حساسیت پراخولو لپاره اړین دی.د miniSOG اوسنۍ نسخې لپاره، د نږدې نښه کونکي فعالولو لپاره د نیلي روښانتیا په کارولو سره لوړ لنډمهاله حل ترلاسه کیدی شي.برسېره پردې، د اوږد مهاله تماس وخت د واحد اکسیجن لوی "بادل" خپور کړ، چې په پایله کې یې د ډیرو لرې هسټیډین پاتې شونو تعدیل، د لیبل کولو وړانګو زیاتوالی، او د PDPL ځایی ریزولوشن ښه کولو وړتیا.موږ اوه کیمیاوي تحقیقات هم ازمویل ترڅو د سیګنال څخه تر شالید تناسب زیات کړي او د دې تګلارې تر شا د مالیکول میکانیزم وپلټئ.د TOP-ABPP کاري فلو د بې طرفه خلاصې لټون سره یوځای تایید کړه چې تعدیلات یوازې په هسټیډینونو کې پیښ شوي او د هسټیډین د زیاتوالي لپاره هیڅ ډول مایکرو چاپیریال نه دی لیدل شوی، پرته له دې چې په لوپ سیمه کې د هسټیډینونو لپاره معتدل غوره توب.
PDPL د پروټوم ځانګړتیا او پوښښ سره د فرعي سیلولر پروټومونو ځانګړتیا لپاره هم کارول شوی چې لږترلږه د نورو نږدې لیبل کولو او ارګانیل ځانګړي کیمیاوي تحقیقاتو میتودونو سره پرتله کیږي.د نږدې والي نښه کونکي هم په بریالیتوب سره د سطحې ځانګړتیاو لپاره کارول شوي، لیزوسومال، او د محرمیت سره تړلي پروټومونه 46,47.موږ باور لرو چې PDPL به د دې فرعي سیلولر ارګانیلز سره مطابقت ولري.برسېره پردې، موږ د سایټوسولیک پروټین پابندۍ لپاره د اهدافو په پیژندلو سره PDPL ننګونه وکړه چې د دوی د متحرک ملکیتونو او په ډیرو لنډمهاله تعاملاتو کې د ښکیلتیا له امله د جھلی پابند پروټینونو څخه ډیر پیچلي دي.PDPL په دوو پروټینونو باندې تطبیق شوی و، د ټرانسکریپشن کواکټیوټر BRD4 او د ناروغۍ سره تړلی لیګیس E3 پارکین.دا دوه پروټینونه نه یوازې د دوی د بنسټیزو بیولوژیکي دندو لپاره غوره شوي، بلکې د دوی کلینیکي تړاو او د درملنې وړتیا لپاره هم غوره شوي.د دې دوو POIs لپاره، پیژندل شوي پابند شریکان او همدارنګه غیر راجستر شوي هدفونه پیژندل شوي.د پام وړ، د مرحلې جلا کولو پورې تړلی پروټین SFPQ د Co-IP لخوا تایید شوی، کوم چې ممکن یو نوی میکانیزم په ګوته کړي چې BRD4 (لنډ isoform) LLPS تنظیموي.په ورته وخت کې، موږ باور لرو چې د پارکین سبسټریټ پیژندنه یوه سناریو ده چې په کې د غیر مستقیم چپکونکو پیژندل اړین دي.موږ دوه ناپیژندل شوي پارکین سبسټریټونه پیژندلي او د هر اړخیز - پروټیزوم لارې په اوږدو کې د دوی تخریب تایید کړی.په دې وروستیو کې، د میکانیزم پر بنسټ د ټراپینګ ستراتیژي رامینځته شوې ترڅو د هایدرولیس سبسټریټونه د انزایمونو سره په ځړولو سره کشف کړي.که څه هم دا یو خورا پیاوړی میتود دی، دا د لویو کمپلیکسونو په جوړولو کې دخیل فرعي سټیټونو تحلیل لپاره مناسب نه دی او د انزایم او سبسټریټ ترمینځ د covalent بانډونو رامینځته کولو ته اړتیا لري.موږ تمه لرو چې PDPL د نورو پروټین کمپلیکسونو او انزایمونو کورنیو مطالعه کولو لپاره وغځول شي ، لکه deubiquitinase او metalloprotease کورنۍ.
د miniSOG یوه نوې بڼه، چې د SOPP3 په نوم یادیږي، د اکسيجن د اکسيجن د ښه تولید سره رامینځته شوی.موږ miniSOG د SOPP3 سره پرتله کړ او د نښه کولو ښه فعالیت مو وموندل، که څه هم د سیګنال څخه تر شور تناسب بدل شوی نه دی (اضافی شکل. 11).موږ داسې انګیرله چې د SOPP3 اصلاح کول (د مثال په توګه د لارښود تکامل له لارې) به د ډیر اغیزمن فوتوسنسیټیزر پروټینونو لامل شي چې د رڼا لنډ وخت ته اړتیا لري او پدې توګه د ډیرو متحرک سیلولر پروسې نیول کیدو ته اجازه ورکوي.د پام وړ، د PDPL اوسنی نسخه د سیلولر چاپیریال پورې محدوده ده ځکه چې دا نیلي رڼا ته اړتیا لري او نشي کولی ژور نسجونو ته ننوځي.دا ځانګړتیا د څارویو ماډل مطالعاتو کې د هغې کارول منع کوي.په هرصورت، د PDPL سره د optogenetics ترکیب کولی شي د څارویو څیړنې لپاره فرصت برابر کړي، په ځانګړې توګه په دماغ کې.برسېره پردې، نور انجنیري انفراریډ فوټوسینټیزر هم دا محدودیت لرې کوي.اوس په دې برخه کې څېړنې روانې دي.
د HEK293T سیل لاین د ATCC (CRL-3216) څخه ترلاسه شوی.د حجرو لاین د مایکوپلازما انفیکشن لپاره منفي ازموینه کړې او په DMEM (Thermo, #C11995500BT) کې د 10٪ جنین بوایین سیرم (FBS, Vistech, #SE100-B) او 1٪ پینسلین/سټریپټومایسین (هایکلون, #SV3) سره ضمیمه شوې.کې لوی شوی
3-Aminophenylene (3 نمونه) او (4-ethynylphenyl) میتانامین (4 نمونه) د Bidepharm څخه اخیستل شوي.پروپیلامین (تحقیق 2) د انرژی کیمیاوی موادو څخه اخیستل شوی.N-(2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (probe 1) د خپرو شویو میتودونو سره سم ترکیب شوی.
ضمیمه جدول 1 په دې څیړنه کې کارول شوي جینیاتي جوړښتونه لیست کوي.د miniSOG او KillerRed ترتیبونه د P. Zou (Peking University) څخه د ډالۍ پلازمید څخه کلون شوي.د مایټوکونډریال میټرکس هدف کولو ترتیب د COX4 د 23 N-ټرمینل امینو اسیدونو څخه اخیستل شوی او د ګیبسن اسمبلۍ (بییوټایم، #D7010S) په کارولو سره په نښه شوي ویکتورونو کې کلون شوی.د Endoplasmic reticulum غشا او نیوکلیو په نښه کولو لپاره، SEC61B انساني DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) د PCR لخوا د HEK293T حجرو د cDNA کتابتون څخه پراخ شوی، او د H2B DNA (د D. Linbory، Ba Shenzhen لخوا مرسته شوی) او کلون شوی، لکه څنګه چې پورته یادونه وشوه.پرته لدې چې بل ډول اشاره شوې وي ، نور پروټین جینونه چې د مستحکم حجرو لاینونو د لیږد او جوړولو لپاره کارول کیږي د HEK293T حجرې cDNA کتابتون څخه PCR پراخه شوي.G3S (GGGS) او G4S (GGGGS) د بیت پروټین او miniSOG ترمنځ د اړیکو په توګه کارول شوي.د V5 اپیټوپ ټګ (GKPIPNPLLGLDST) دې فیوژن جوړښتونو کې اضافه شوی.په تی لرونکو حیواناتو کې د څرګندولو او د باثباته حجرو لاین رامینځته کولو لپاره ، د miniSOG فیوژن جوړښت د pLX304 lentiviral ویکتور کې ضمیمه شوی و.د باکتریا څرګندولو لپاره، miniSOG په C-terminus کې د 6xHis لیبل شوي pET21a ویکتور کې کلون شوی و.
د HEK293T حجرې د 2.0 x 105 حجرې په هر څاه کې په شپږ څاه ګانو کې تخم شوي او 24 ساعته وروسته د بیا جوړونکي lentiviral plasmids (2.4 μg pLX304) او د ویروس بسته بندۍ پلاسمیډونو (1.5 μg psPAX2 او 1.2 μg psPAX2 او 1.2 μg 1.2 μg) د Lipod0 μg08 وخت په کارولو سره انتقال شوي. ، #C0533)، شاوخوا 80٪ فیوژن.د شپې له لیږد وروسته، منځنی بدل شو او د نورو 24 ساعتونو لپاره انکیوب شوی.د ویروس راټولول له 24، 48 او 72 ساعتونو وروسته ترسره شوي.د هدف حجرو لاینونو د انفیکشن دمخه، ویروس منځنی د 0.8 μm فلټر (Merck, #millex-GP) له لارې فلټر شوی و او پولیبرین (Solarbio, #H8761) د 8 μg/ml غلظت کې اضافه شوی و.د 24 ساعتونو وروسته، حجرو ته اجازه ورکړل شوه چې د منځني بدلولو سره بیرته راشي.حجرې د 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) په کارولو سره د لومړیو دریو برخو لپاره د ټیټ سخت انتخاب په توګه غوره شوي.بیا د راتلونکو دریو برخو لپاره 20 μg/ml د ډیر سخت رژیم په توګه کارول کیږي.
حجرې په 12 څاه ګانو کې تخم شوي (Ibidi, #81201) په هر څاه کې د نږدې 20,000 حجرو په کثافت کې.د HEK293T حجرو د چپه کولو د ښه کولو لپاره، 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) د فاسفیت بفر شوي مالګین (PBS, Sangon, #B640435) کې په 37 درجې سانتي ګراد کې حل کړئ.چیمبرونه د 1 ساعت لپاره پری درملنه شوي او بیا د PBS سره لیرې شوي.د 24 ساعتونو وروسته، حجرې یو ځل د PBS سره مینځل شوي، د 1 mM پروب 3 سره د تازه هانکس متوازن مالګې محلول (HBSS, Gibco, #14025092) کې د 1 h لپاره په 37 درجې سانتي ګراد کې مینځل شوي، او بیا په نیلي LED (460 nm) سره سینګار شوي. ).) د خونې په حرارت کې د 10 دقیقو لپاره شعاع شوي.له هغې وروسته، حجرې دوه ځله د PBS سره مینځل شوي او د 4% formaldehyde سره په PBS (سنګون، #E672002) کې د خونې په حرارت کې د 15 دقیقو لپاره تنظیم شوي.اضافي formaldehyde د PBS سره درې ځله مینځلو سره د ثابت حجرو څخه لیرې شوي.بیا حجرې په PBS کې د 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) سره پراخې شوې او د PBS سره 3 ځله مینځل شوې.بیا چیمبر لیرې کړئ او هرې نمونې ته 25 μl د کلک عکس العمل مخلوط اضافه کړئ چې پکې 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720)، 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008)، 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) او 0.5 mg/ml sodium ascorbate (Aladin, no. S105024) او د خونې په حرارت کې د 30 دقیقو لپاره کیښودل کیږي.د عکس العمل وروسته، حجرې شپږ ځله د PBS سره مینځل شوي چې 0.05٪ Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) لري او بیا د 5٪ BSA (Abcone, #B24726) سره په PBST کې د 30 دقیقو لپاره د خونې په حرارت کې بندې شوې.
د ټولیز کولو معافیت لپاره، حجرې د ښودل شوي شرایطو سره سم د لومړني انټي باډیزونو سره انکیوب شوي: د موږک ضد V5 tag mAb (1:500, CST, #80076) ، د خرگوش ضد Hsp60 mAb (1:1000) ، ABclonal, #A0564) د خرگوش پولی کلونل انټي کالنیکسین انټي باډي (1:500, Abcam, #ab22595) یا د خرگوش ضد لامین A/C مونوکلونل انټي باډي (1:500; CST, #2032) د شپې په 4 °C کې.د PBST سره د 3 ځله مینځلو وروسته، حجرې د ثانوي انټي باډونو سره انکیوب شوي: د وزې ضد الیکسا فلور 488 (Thermo, #A11034) 1:1000 کم شوی، د وزې ضد موږک الیکسا فلور 594 (CST, #8889) 1:100 کم شوی.د خونې د حرارت درجه د 30 دقیقو لپاره کم کړئ.بیا حجرې د PBST سره 3 ځله ومینځل شوې او د DAPI (Thermo, #D1306) سره په PBS کې د 10 دقیقو لپاره د خونې په حرارت کې ومینځل شوې.د PBS سره د 3 مینځلو وروسته، حجرې د انځور کولو لپاره په PBS کې په 50٪ ګیلیسرول (سنګون، #A600232) کې مهر شوي.Immunofluorescent انځورونه د ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal مایکروسکوپ او ZNE 3.5 سافټویر په کارولو سره ترلاسه شوي.
د واحد اکسیجن فلوروسینټ امیجنگ لپاره، حجرې دوه ځله د Hanks HEPES بفر سره مینځل شوي مخکې له دې چې په Hanks HEPES بفر کې 100 nM Si-DMA اضافه کړي (DOJINDO, #MT05).د رڼا سره د تماس وروسته، حجرې د 45 دقیقو لپاره په 37 ° C کې د CO2 انکیوبیټر کې ځای پرځای شوي.بیا حجرې دوه ځله د Hanks HEPES بفر سره مینځل شوي او د هانکس HEPES بفر کې د 10 دقیقو لپاره د خونې په حرارت کې د Hoechst سره کاونټرسټین شوي او د ZEISS LSM 900 confocal مایکروسکوپ په کارولو سره لیدل شوي.، #M36008) په HBSS بفر کې چې کلسیم او مګنیزیم لري.د رڼا یا doxorubicin (MCE, #HY-15142A) سره د تماس وروسته، حجرې په CO2 انکیوبیټر کې د 37 درجې سانتي ګراد کې د 10 دقیقو لپاره کینول شوي، دوه ځله د HBSS بفر سره مینځل شوي، او د HBSS بفر کې د Hoechst سره د خونې د حرارت درجه کې مینځل شوي.دقیقېDoxorubicin د مثبت تحقیقاتي کنټرول په توګه کارول کیده چیرې چې حجرې په HBSS کې د 20 μM doxorubicin سره درملنه شوې چې 1٪ BSA لري د 30 دقیقو لپاره.Immunofluorescent انځورونه د Zeiss LSM 900 confocal مایکروسکوپ په کارولو سره ترلاسه شوي.
د HEK293T حجرې په ثابت ډول د mito-miniSOG څرګندونه کوي په 15 سانتي لوښو کې د نږدې 30٪ په کثافت کې تخم شوي.د 48 ساعتونو وروسته، کله چې د ~ 80٪ ترکیب ته ورسید، حجرې یو ځل د PBS سره ومینځل شوې، د 1 mM Probe 3 سره په تازه HBSS بفر کې د 1 ساعت لپاره په 37 درجې سانتي ګراد کې دننه شوي او بیا په خونه کې د 10 دقیقو لپاره د نیلي LED سره روښانه شوي. حرارت.بیا وروسته، حجرې دوه ځله د PBS سره مینځل شوي، سکریپ شوي او د یخ سرد PBS بفر کې بیا ځای پرځای شوي چې د EDTA-free پروټیز مخنیوی کونکي لري (MCE, #HY-K0011).حجرې د 1 دقیقو لپاره د ټیپ د سونیک کولو له لارې لیز شوي (1 ثانیه په 35٪ طولیت کې 1 ثانیه بنده).پایله لرونکی مخلوط په 15,871 xg کې د 10 دقیقو لپاره په 4°C کې د کثافاتو لرې کولو لپاره سینټرفیوژ شوی و، او د سوپرناټینټ غلظت د BCA پروټین د ارزونې کټ (Beyotime, #P0009) په کارولو سره 4 mg/mL ته تنظیم شوی و.1 ملی لیتر پورتنی لیسیټ د 0.1 ملی میتر فوتوډیګریډیبل بایوټین ایزایډ (Confluore, #BBBD-14)، 1 mM TCEP (Sangon, #A600974)، 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437)، او 1mM Cuubator د لاندې سره ګډ کړئ. د خونې په حرارت کې د 1 ساعت لپاره حرکت کول.د عکس العمل وروسته، مخلوط د 10 ملی لیتر شیشې شیشې کې مخکې مخلوط شوي محلول (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) ته اضافه کړئ.نمونې د خونې په حرارت کې د 10 دقیقو لپاره په 4500 ګرامه کې مخلوط شوي او سینټرفیوج شوي.ښکته او پورتنۍ محلولونه له مینځه وړل شوي، باران دوه ځله د 1 ملی لیتر میتانول سره مینځل شوی او په 15871xg کې د 5 دقیقو لپاره په 4 درجې سانتي ګراد کې سینټرفیوج شوی.1 ملی لیتر 8 M یوریا (Aladdin, no. U111902) په 25 mM امونیم بای کاربونیټ (ABC, Aladdin, No. A110539) کې اضافه کړئ ترڅو د اورښت تحلیل شي.نمونې د 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 په 25 mm ABC کې) سره د 40 دقیقو لپاره په 55 درجې سانتي ګراد کې بیا تنظیم شوي او بیا د 15 ملي میتر تازه iodoacetamide (Sangon, #A600539) په تیاره کې د خونې په حرارت کې اضافه شوي.د 30 دقیقو دننه الکوليشن..د عکس العمل د مخنیوي لپاره اضافي 5 mM dithiothreitol اضافه شوي.د هرې نمونې لپاره نږدې 100 µl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) چمتو کړئ د 1 ml PBS سره 3 ځله مینځل.پورتني پروټوم محلول د 5 ملی لیتر PBS سره مینځل شوی او د خونې په حرارت کې د 4 ساعتونو لپاره دمخه مینځل شوي NeutrAvidin agarose مالا سره مینځل شوي.بیا موزۍ 3 ځله د 5 ml PBS سره چې 0.2% SDS لري (Sangon, #A600485)، 3 ځله د 5 ml PBS سره چې 1M یوریا لري، او 3 ځله د 5 ml ddH2O سره مینځل شوي.بیا مڼې د سینټرفیوګیشن پواسطه راټولې شوې او په 200 μl کې د 25 mM ABC کې 1 M یوریا، 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) او 20 ng/μl ټریپسین (Promega, #V5280) شامل دي.Trypsinize د شپې په 37 ° C کې د گردش سره.عکس العمل د فارمیک اسید (Thermo, # A117-50) په اضافه کولو سره ودرول شو تر هغه چې pH 2-3 ته ورسیږي.مڼې 3 ځله د 1 ملی لیتر PBS سره چې 0.2٪ SDS لري، 3 ځله د 1 ملی لیتر PBS سره چې 1 M یوریا لري، او بیا 3 ځله د 1 ملی لیتره اوبو سره مینځل شوي.تعدیل شوي پیپټایډونه د 90 دقیقو لپاره د رڼا لیسز (365 nm) لخوا د 200 μl د 70٪ MeOH په کارولو سره خوشې شوي.د سینټرفیوګریشن وروسته، سپرناټینټ راټول شو.بیا مڼې یو ځل د 100 μl د 70% MeOH سره ومینځل شوې او سپرناټینټ راټول شوي.نمونې په سپیډواک ویکیوم متمرکز کې وچې شوې او تر تحلیل پورې په -20 ° C کې زیرمه شوې.
د واحد اکسیجن تعدیل شوي پیپټایډونو پیژندلو او اندازه کولو لپاره، نمونې په 0.1٪ فارمیک اسید کې بیا حل شوي او 1 μg پیپټایډونه د اوربیټراپ فیوژن Lumos Tribrid ماس سپیکٹرومیټر په کارولو سره تحلیل شوي چې د وینډر سافټویر 43 څخه د Tune او Xcalibur څخه د نانو ESI سرچینې سره سمبال شوي.نمونې د 75 µm × 15 سانتي مترو په داخلي کڅوړه کې د 3 µm C18 موادو (ReproSil-pur, #r13.b9.) سره جلا شوي او د EASY-nLC 1200 UHPLC سیسټم (Thermo) سره وصل شوي.پیپټایډونه د خطي 95 دقیقې تدریجي کروماتګرافي په واسطه له 8٪ محلول B څخه 50٪ محلول B (A = 0.1٪ فارمیک اسید په اوبو کې ، B = 0.1٪ فارمیک اسید په 80٪ acetonitrile کې) جلا شوي ، بیا په خطي ډول 98٪ B min ته لوړ شوي. په 6 دقیقو کې د 300 nl/min په جریان کې.Orbitrap Fusion Lumos د معلوماتو پر بنسټ د بشپړ MS سکین او MS2 سکین ترمنځ په بدیل سره ډاټا راټولوي.د تودوخې ولتاژ 2.1 kV ته ټاکل شوی و او د آیون ټرانسپورټ کیپیلري تودوخه 320 ° C وه.MS سپیکٹرا (350-2000 m/z) د 120,000 ریزولوشن سره راټول شوي، AGC 4 × 105، او د 150 ms اعظمي ان پټ وخت.په هر بشپړ سکین کې 10 خورا عام ضرب چارج شوي مخکیني د HCD په کارولو سره د 30٪ نورمال شوي ټکر انرژي سره ټوټه ټوټه شوي ، د 1.6 m/z د کواډرپول جلا کولو کړکۍ ، او د 30,000 ریزولوشن ترتیب.د 5×104 په کارولو سره د ټنډیم ماس سپیکرومیټري لپاره د AGC هدف او اعظمي ان پټ وخت 150 ms.متحرک استثنا د 30 ثانیو لپاره ټاکل شوې. نه ټاکل شوي آیونونه یا هغه څوک چې د 1+ او>7+ چارج لري د MS/MS لپاره رد شوي. نه ټاکل شوي آیونونه یا هغه څوک چې د 1+ او>7+ چارج لري د MS/MS لپاره رد شوي. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. د 1+ او>7+ چارج سره غیر ټاکل شوي ایونونه یا ایونونه د MS/MS لپاره رد شوي.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. د 1+ او>7+ تورونو سره غیر مشخص شوي ایونونه یا آئنونه د MS/MS لپاره رد شوي.
خام معلومات د MSFragger پراساس د FragPipe کمپیوټري پلیټ فارم په کارولو سره پروسس کیږي.ډله ایز تعصب او اړونده امینو اسیدونه د خلاص لټون الګوریتم په کارولو سره د -150 څخه تر 500 Da پورې د مخکیني ډله ایز زغم سره ټاکل شوي.تعدیل شوي پیپټایډونه بیا د هسټیډین تعدیلاتو په کارولو سره په PD کې د +229.0964 او +247.1069 Da ډله ایزو لاسته راوړنو سره پیژندل شوي (د پروټوم کشف کونکي 2.5، ترمو).
هغه حجرې چې په ثابت ډول د miniSOG جین څرګندونه کوي په 6 سانتي لوښو کې پلی شوي.د ~ 80% سنگم ته رسیدو سره، حجرې یو ځل د HBSS (Gibco, #14025092) سره مینځل شوي، بیا په HBSS کې د کیمیاوي تحقیقاتو سره د 1 ساعت لپاره د 37 درجې سانتي ګراد او نیلي رڼا سره روښانه شوي.د خونې په حرارت کې د 20 دقیقو لپاره 10W LED.د دې معلومولو لپاره چې کوم ډول عکس العمل اکسیجن ډولونه په PDPL کې شامل دي، 0.5 mM ویټامین C (MCE, #HY-B0166)، 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445)، D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM منیټول (د انرژي کیمیاوي، #69-65-8)، 100 μM H2O2، 10 mM NaN3 حجرو ته د اضافي موادو په توګه اضافه شوي.د سړې پی بی ایس سره مینځل وروسته، حجرې سکریپ شوي، په 1.5 ملی لیتر سینټرفیوج ټیوب کې راټول شوي، او د 1 دقیقو لپاره د 200 μl PBS کې د 1x protease inhibitor سره پرته له EDTA (1 s او 1 s پرته، طول 35٪).نتیجه اخیستونکی مخلوط په 15,871 × g کې د 10 دقیقو لپاره په 4 ° C کې سنټرفیوژ شوی او د سپرناټینټ غلظت د BCA پروټین د ارزونې کټ په کارولو سره 1 mg/mL ته تنظیم شوی.د پورتني lysate شاوخوا 50 µl د 0.1 mM rhodamine azide (Aladin, no. T131368)، 1 mM TCEP، 0.1 mM TBTA ligand، او 1 mM CuSO4 د خونې په حرارت کې د 1 ساعت لپاره له لاندې څخه تر پورتنۍ حرکت سره مینځل شوي.د کلک عکس العمل وروسته، د اسیټون سره باران په نمونو کې د 250 μl دمخه یخ شوي اکټون اضافه کولو سره ترسره شو، د 20 دقیقو لپاره په -20 ° C کې د 20 دقیقو لپاره او په 6010×g کې د 10 دقیقو لپاره په 4°C کې سینټرفیوګ کول.ګولۍ راټول کړئ او په 50 µl 1x Laemmli بفر کې د 10 دقیقو لپاره په 95 ° C کې جوش کړئ.بیا نمونې د SDS-PAGE اوږد جیلونو کې تحلیل شوي او د عکس لابراتوار ټچ سافټویر سره د Bio-rad ChemiDoc MP ټچ امیجنگ سیسټم په کارولو سره لیدل شوي.
د بیا جوړونکي miniSOG-6xHis پروټین څرګندول او پاکول لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي ترسره شوي.په لنډه توګه، د E. coli BL21(DE3) حجرې (TransGen, #CD701-02) د pET21a-miniSOG-6xHis سره بدل شوي او د پروټین اظهار د 0.5 mM IPTG (سنګون، #A600168) سره هڅول شوی.د حجرو له لیسز وروسته، پروټینونه د Ni-NTA agarose beads (MCE، شمیره 70666) په کارولو سره پاک شوي، د PBS په مقابل کې ډیالیز شوي، او په -80 ° C کې زیرمه شوي.
د انټي باډي پراساس د ویټرو لیبل قربت ارزونې لپاره ، په PBS کې 100 μM پاک شوی miniSOG ، 1 mM پروب 3 ، او 1 μg انټي لیبل ماوس مونوکلونل انټي باډي (TransGen, #HT501-01) د 50 μl ټول عکس العمل حجم سره مخلوط کړئ..د عکس العمل مخلوط د خونې په حرارت کې د 0، 2، 5، 10، او 20 دقیقو لپاره د نیلي LED څراغ سره روښانه شوی و.دا مخلوط د 0.1 mM بایوټین-PEG3-azide (Aladdin, #B122225)، 1 mM TCEP، 0.1 mM TBTA ligand، او 1 mM CuSO4 سره د خونې په حرارت درجه کې د 1 ساعت لپاره د پورته حرکت شیکر کې اچول شوی و.د عکس العمل وروسته، د 4x لایملي بفر په مستقیم ډول مخلوط ته اضافه کړئ او د 10 دقیقو لپاره په 95 درجو کې جوش کړئ.نمونې په SDS-PAGE gels کې تحلیل شوي او د سټرپټاویډین-HRP (1:1000، سولاربیو، #SE068) سره د لویدیځ بلاټینګ لخوا تحلیل شوي.
یو هسټیډین لرونکی مصنوعي پیپټایډ د C-ټرمینل امایډیشن (LHDALDAK-CONH2) سره د ویټرو لیبلینګ کې د نږدې پیپټایډ میشته تحلیل لپاره کارول شوی و.په دې ارزونه کې، د 100 μM پاک شوی miniSOG، 10 mm probe 3 او 2 μg/ml مصنوعي پیپټایډ په PBS کې د 50 μl ټول غبرګون حجم کې مخلوط شوي.د عکس العمل مخلوط د خونې په حرارت کې د 1 ساعت لپاره د نیلي LED څراغ سره روښانه شوی و.د نمونې یو مایکرو لیټر د LC-MS سیسټم په کارولو سره تحلیل شو (واټرز، SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer with MassLynx spectrum analysis software).
د HEK293T حجرې په ثابت ډول د miniSOG فیوژن جین څرګندونه کوي په 10 سانتي لوښو کې تخمونه د مختلف ارګانیل ځایی کولو (میټو، ER، نیوکلیوس) سره او د پارکین-miniSOG او BRD4-miniSOG لینونو لپاره 15 سانتي لوښو کې تخم شوي.د ~ 90% سنگم ته رسیدو سره، حجرې یو ځل د HBSS سره ومینځل شوې، بیا په HBSS کې د 37 درجې په حرارت کې د 1 ساعت لپاره پروب 3 سره سینګار شوي او د خونې په حرارت کې د 10 W نیلي LED سره روښانه شوي.د پارکین د غیر تماس لیبل کولو لپاره، 10 µM پروټون کاربونیل سیانایډ کیریر m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) د پروب 3 سره په HBSS کې د 1 ساعت لپاره په 37 درجو کې اضافه شوي.د حجرو لیسیز، کلک کیمیا، کمښت او د الکیلیشن مرحلې یو شان وې لکه څنګه چې پورته بیان شوي، پرته له دې چې 2 ملی ګرامه لیسټیټ اضافه شوي او بایوټین PEG3 azide د عکس العمل بایوټین ایزایډ پر ځای په کلک غبرګون کې کارول شوي.د غني کولو وروسته، مچۍ 3 ځله د 5 ml PBS سره چې 0.2% SDS لري، 3 ځله د 5 ml PBS سره چې 1 M یوریا لري، او 3 ځله د 5 ml PBS سره مینځل شوي.بیا وروسته، 2 µg ټریپسین په 300 µl 25 mM ABC کې اضافه شوي چې 1 M یوریا لري ترڅو د شپې په 37 درجې سانتي ګراد کې پروټین پاک کړي.عکس العمل د فارمیک اسید په اضافه کولو سره ودرول شو تر هغه چې pH 2-3 ته ورسیږي.په مچیو باندې د ټریپسین کولو وروسته، د پیپټایډ محلول د SOLAµ HRP کالم (Thermo, #60209-001) په کارولو سره پاک شوی او په سپیډواک ویکیوم متمرکز کې وچ شوی.پیپټایډونه په 0.1% فارمیک اسید کې بیا منحل شوي او 500 ng پیپټایډونه د Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer په کارولو سره تحلیل شوي چې د پورته ذکر شوي نانو-ESI سرچینې سره مجهز شوي.پیپټایډونه په تجارتي RP-HPLC مخکینۍ کالمونو (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) او تحلیلي RP-HPLC کالمونو (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941) کې جلا شوي، دواړه د 2 μm سره ډک شوي.په 60 دقیقو کې له 8٪ څخه تر 35٪ ACN پورې تدریجي ، بیا په 6 دقیقو کې د 300 Nl/min د جریان په نرخ کې په خطي ډول 98٪ B ته لوړیږي.MS سپیکٹرا (350-1500 m/z) د 60,000 ریزولوشن سره راټول شوي، AGC 4 × 105، او د 50 ms اعظمي ان پټ وخت.ټاکل شوي آیونونه په ترتیب سره د HCD لخوا په 3 ثانیو کې د 30٪ نورمال شوي ټکر انرژي سره ټوټه ټوټه شوي، د 1.6 m/z د کواډروپول جلا کولو کړکۍ، او د 15000 ریزولوشن. د 5 × 104 ټنډیم ماس سپیکٹرومیټر AGC هدف او اعظمي انجیکشن وخت 22 ms کارول شوي.متحرک جالوالی 45 ثانیو ته ټاکل شوی. نه ټاکل شوي آیونونه یا هغه څوک چې د 1+ او>7+ چارج لري د MS/MS لپاره رد شوي. نه ټاکل شوي آیونونه یا هغه څوک چې د 1+ او>7+ چارج لري د MS/MS لپاره رد شوي. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. د 1+ او>7+ چارج سره غیر ټاکل شوي ایونونه یا ایونونه د MS/MS لپاره رد شوي.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. د 1+ او>7+ تورونو سره غیر مشخص شوي ایونونه یا آئنونه د MS/MS لپاره رد شوي.
د نمونې چمتو کولو مرحلې د NeutrAvidin موزونو بډایه کولو پورې ورته وو لکه څنګه چې پورته تشریح شوي LC-MS/MS تحلیل کې.نږدې 50 μg lysate د بارولو کنټرول لپاره د ان پټ په توګه کارول شوي او 2 mg lysate د کلک عکس العملونو لپاره کارول شوي.د نیوتراویډین سره د بډایه کولو او مینځلو وروسته، تړل شوي پروټینونه د 50 μl د لایملي بفر د اګروز رال د مچیو په اضافه کولو او په 95 درجو سانتي مترو کې د 5 دقیقو لپاره په جوش کولو سره له مینځه وړل شوي.د کنټرول بار ان پټ او د مالګې بډایه شوي نمونې د SDS-PAGE لخوا تحلیل شوي او د معیاري لویدیځ بلاټ میتودونو په واسطه د PVDF جھلی (Millipore, #ISEQ00010) ته لیږدول شوي.غشا په TBS کې د 5% سکم شیدو (Sangon, #A600669) سره بند شوي چې 0.1% tween-20 (TBST) لري او په ترتیب سره د لومړني او ثانوي انټي باډیز سره مینځل شوي.لومړني انټي باډي په TBST کې په 5% سکم شیدو کې 1: 1000 کم شوي او د شپې په 4 درجې سانتي ګراد کې مینځل شوي.ثانوي انټي باډي د 1:5000 په تناسب کې کارول شوي او د خونې په حرارت کې د 1 ساعت لپاره مینځل شوي.جھلی د کیمیلومینیسینس لخوا د Chemidoc MP امیجنگ سیسټم په کارولو سره لیدل شوي.په شکل کې د بلاټونو او جیلونو ټول ناپاک شوي سکینونه د خام ډیټا په توګه وړاندې شوي.
لومړني انټي باډي چې پدې څیړنه کې کارول شوي د خرگوش ضد SFPQ مونوکلونل انټي باډي (CST، نمبر 71992)، د خرگوش ضد FUS مونوکلونل انټي باډي (CST، نمبر 67840)، د خرگوش ضد NSUN2 پولی کلونل انټي باډي (پروټینټیک، شمیره 20854-1- AP)، د خرگوش ضد mSin3A پولی کلونل انټي باډي (Abcam, #ab3479)، د موږک ضد ټاګ مونوکلونل انټي باډي (TransGen, #HT201-02)، د موږک ضد β-actin مونوکلونل انټي باډي (TransGen, #HC201-01)، د خرگوش ضد -CDK2 مونوکلونل انټي باډي (ABclonal, #A0094)، د خرگوش مونوکلونل انټي باډي CTBP1 ته (ABclonal, #A11600)، د خرگوش پولي کلونل انټي باډي د DUT (ABclonal, #A2901)، د خرگوش پولي کلونل انټي باډي PSMC4 ته (ABclonal, #A250)، انټي باډي DNAJB1 پولی کلونل انټي باډي (ABclonal, # A5504).دا انټي باډي په TBST کې د 5% سکیم شیدو کې د 1:1000 کمولو کې کارول شوي.په دې څیړنه کې کارول شوي ثانوي انټي باډي شامل دي د خرگوش ضد IgG (TransGen, #HS101-01)، د موږک ضد IgG (TransGen, #HS201-01) په 1:5000 کمولو کې.
د لا زیاتو څیړلو لپاره چې آیا BRD4 د SFPQ سره اړیکه لري، د HEK293T مستحکم HEK293T او BRD4-miniSOG حجرې د 10 سانتي مترو په لوښو کې پلی شوي.حجرې د سړې PBS سره مینځل شوي او په 1 ملی لیتر پییرس IP لیسیز بفر (Thermo Fisher, #87787) کې د EDTA-free protease inhibitor سره د 30 دقیقو لپاره په 4°C کې لیز شوي.له هغې وروسته، lysates په 1.5 ملی لیتر سنټرفیوج ټیوبونو کې راټول شوي او په 15,871 xg کې د 10 دقیقو لپاره په 4 درجو کې سنټرفیوج شوي.سپرناټینټ د شپې په 4 درجې سانتي ګراد کې د 5 µg انټي V5 لیبل شوي موږک مونوکلونل انټي باډي (CST, #80076) سره راټول شوی او سینګار شوی.نږدې 50 µl پروټین A/G مقناطیسي موتی (MCE, #HY-K0202) دوه ځله د PBS سره چې 0.5% Tween-20 لري ومینځئ.بیا د حجرو lysates د مقناطیسي موتی سره د 4 ساعتو لپاره په 4 درجو سانتي ګراد کې د ښکته څخه پورته ته د څرخیدو سره مینځل شوي.بیا موزونه څلور ځله د 1 ملی لیتر PBST بفر سره مینځل شوي او د 5 دقیقو لپاره په 95 درجو کې جوش شوي.نمونې په SDS-PAGE جیلونو کې تحلیل شوي او د معیاري لویدیځ بلاټ میتودونو په کارولو سره PVDF جھلی ته لیږدول شوي.غشا په TBST کې په 5% سکیم شیدو کې بند شوي او په ترتیب سره د لومړني او ثانوي انټي باډیز سره مینځل شوي.د لومړني انټي باډي خرگوش ضد SFPQ مونوکلونل انټي باډي (CST, #71992) په TBST کې د 5% سکیم شیدو کې د 1:1000 په تناسب کارول شوی او د شپې په 4 درجې سانتي ګراد کې سینګار شوی.د خرگوش ضد IgG د 1:5000 په تناسب کې کارول شوی او د خونې په حرارت کې د 1 ساعت لپاره مینځل شوی.جھلی د کیمیلومینیسینس لخوا د Chemidoc MP امیجنگ سیسټم په کارولو سره لیدل شوي.
ټول جوړښتونه چې د محلول د لاسرسي وړ سطحې ساحې (SASA) تحلیل لپاره کارول کیږي د پروټین ډیټا بانک (PDB)52 یا د الفا فولډ پروټین جوړښت ډیټابیس 53 څخه ترلاسه شوي.مطلق SASA د FreeSASA برنامې په کارولو سره د هرې پاتې کیدو لپاره محاسبه شوی.د لیبل شوي هسټیډین او د هغې ګاونډیانو لپاره یوازې بشپړ او غیر واضح SASA ډیټا د هر جوړښت لپاره د SASA معنی ترلاسه کولو لپاره کارول شوي.د هر هسټیډین لپاره نسبي محلول لاسرسي (RSA) د محلول لپاره د موجود احتمالي اعظمي احتمالي پاتې شونو سطحې ساحې لخوا د مطلق SASA ارزښت په ویشلو سره محاسبه شوې.ټول هسټیډینونه بیا د پټو په توګه طبقه بندي شوي که چیرې د RSA منځنۍ کچه له 20٪ څخه کم وي، که نه نو افشا شوي56.
په DDA حالت کې ترلاسه شوي خام فایلونه د Proteome Discoverer (v2.5) یا MSfragger (Fragpipe v15.0) په کارولو سره په مناسب سویس پروټ تصدیق شوي پروټین ډیټابیس کې پلټل شوي چې عام ککړونکي لري.پیپټایډونه د دوه ورک شوي فاصلو سایټونو سره بشپړ ټریپسین ته اړتیا لري، کاربامویل میتیلیشن د ثابت ترمیم په توګه او میتیونین اکسیډیشن د متحرک تعدیل په توګه.د مخکینۍ او ټوټې وزن زغم په ترتیب سره 10 ppm او 0.02 Da (MS2 Orbitrap) ته ټاکل شوي. ککړتیاوې لیرې شوې، او پروټینونه فلټر شوي ترڅو د <1٪ غلط کشف کچه ترلاسه کړي. ککړتیاوې لیرې شوې، او پروټینونه فلټر شوي ترڅو د <1٪ غلط کشف کچه ترلاسه کړي. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициент ложного обя1ру %. ککړتیاوې لیرې شوي او پروټینونه فلټر شوي ترڅو د غلط کشف کچه <1٪ ورکړي.去除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1% 错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружени %1. ککړتیاوې لیرې شوي او پروټینونه فلټر شوي ترڅو د غلط مثبت شرح <1٪ ترلاسه کړي.د لیبلونو کارولو پرته د کمیتي تحلیل لپاره، د دریو بیولوژیکي تکرارونو څخه نورمال شوي پروټین مواد کارول شوي.د پروټین فرعي سیلولر محلي کولو تحلیل د DAVID بایو انفارماتیک سرچینو ، MitoCarta 3.0 او ډیټابیسونو څخه د جین اونټولوژي (GO) تحلیل په کارولو سره ترسره شو چې د الیس ټینګ ګروپ لخوا ترتیب او خپور شوی.د آتش فشان نقشه د Perseus (v1.6.15.0) څخه ترلاسه شوې. د پروټین د کثرت فولډ بدلونونه د احصایوي اهمیت لپاره د دوه اړخیزه ټ-ټیسټ په کارولو سره ازمول شوي، او د پروټین زیانونه د کثرت بدلون سره پیژندل شوي> 2 (مګر که بل ډول ویل شوي) او p ارزښت <0.05. د پروټین د کثرت فولډ بدلونونه د احصایوي اهمیت لپاره د دوه اړخیزه ټ-ټیسټ په کارولو سره ازمول شوي، او د پروټین زیانونه د کثرت بدلون سره پیژندل شوي> 2 (مګر که بل ډول ویل شوي) او p ارزښت <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. د پروټین مینځپانګې فولډ بدلونونه د احصایوي اهمیت لپاره د دوه اړخیزه ټیسټ ټیسټ په کارولو سره ازمول شوي ، او د پروټین میچونه د مینځپانګې بدلون>2 سره پیژندل شوي (مګر که بل ډول یادونه شوې نه وي) او د AP ارزښت <0.05.a 双边 tf 检验检验 蛋白质测试 丰度丰度 变化显着性 统计统计 显着性统计 显着性中 显着性命 显着性命 中的 丰度的 丰度的 的的 丰度的 丰度 的 丰度 的的 丰度说明 (并 蛋白质另 中中) 和和 丰度 p 和 p 和 p 和 p 值 <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. د پروټین په مینځپانګه کې د فولډ بدلونونو احصایوي اهمیت د دوه اړخیزه ټ-ټیسټ په کارولو سره ازمول شوی و ، او د پروټین میچونه د مینځپانګې بدلونونو لپاره ټاکل شوي > 2 (مګر که بل ډول ښودل شوي) او p - ارزښت <0.05.د پروټین تعامل تحلیل د سټینګ ډیټابیس سره د GO تحلیل په کارولو سره ترسره شو.
درې بیولوژیکي نقلونه د ورته پایلو سره ترسره شوي.احصایوي تحلیل د GraphPad Prism (GraphPad سافټویر) سره ترسره شوي او د آتش فشاني پلاټونه د Perseus (v1.6.15.0) سره رامینځته شوي.د دوو ګروپونو پرتله کولو لپاره، د p-values ​​د دوه پایه زده کونکي ټ-ټیسټ په کارولو سره ټاکل شوي.یوازې سنگلټون پروټینونه چې لږترلږه دوه ځله په تجربه لرونکي ګروپ کې پیژندل شوي د آتش فشاني پلاټونو کې شامل شوي ، او د کنټرول ګروپ کې ورته ورک شوي ارزښتونه د نورمال توزیع څخه د Perseus سره بدل شوي ترڅو د p-value محاسبه شي.د تېروتنې بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.د احصایوي تحلیلونو لپاره پروټومیک تحلیلونو کې، د پروټینونو کثرت چې لږترلږه دوه بیولوژیکي نقلونو کې څرګند شوي ساتل شوي.احصایوي میتودونه د نمونې اندازې دمخه ټاکلو لپاره ندي کارول شوي.تجربې تصادفي ندي.څیړونکي د پایلو د تجربې او ارزونې په جریان کې د دندو په اړه سترګې پټې نه وې.
د مطالعې ډیزاین په اړه د لا زیاتو معلوماتو لپاره، د دې مقالې سره تړلی د طبیعت څیړنې راپور لنډیز وګورئ.
پدې څیړنه کې ترلاسه شوي ډله ایز سپیکرومیټري ډیټا د ډیټاسیټ ID PXD034811 (PDPL-MS ډیټاسیټ) لاندې د iProX57 شریک ذخیره له لارې د پروټوم ایکسچینج کنسورشیم ته سپارل شوي.خام ډاټا د خام ډیټا فایلونو په بڼه چمتو شوي.دا مقاله اصلي معلومات وړاندې کوي.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. د ګاونډیو پیژندل: ​​د پروټین کمپلیکسونو او نقشه ارګانیلونو ځانګړتیا لپاره د نږدې پورې تړلي بایوټینیلیشن کارول. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. د ګاونډیو پیژندل: ​​د پروټین کمپلیکسونو او نقشه ارګانیلونو ځانګړتیا لپاره د نږدې پورې تړلي بایوټینیلیشن کارول.Gingras, AS, Abe, KT او Raut, B. د چاپېریال سره پیژندنه: د پروټین کمپلیکسونو او نقشه ارګانیلونو ځانګړتیا لپاره د نږدې پورې تړلي بایوټینیلیشن کارول. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. د ګاونډ درک کول: د بیولوژیکي ژوند په اړه د ګاونډیو له انحصار څخه کار واخلئ.Gingras, AS, Abe, KT او Raut, B. د نژدي پوهیدل: د پروټین کمپلیکس ځانګړتیاوې او د ارګانیلز نقشه کول د نږدې پورې تړلي بایوټینیلیشن په کارولو سره.اوسنۍ.زما نظر.کیمیاوي.بیولوژي 48، 44-54 (2019).
Geri، JB et al.د معافیت حجرو ته د ډیکسټر انرژي لیږدولو سره د مایکرو چاپیریال نقشه کول.ساینس 367، 1091-1097 (2020).
Hertling، EL et al.دوه پروټوم پیمانه شبکې د انسان متقابل عمل د حجرو ځانګړي ریموډلنګ کشف کوي.حجرې 184، 3022–3040.e3028 (2021).