خبرونه

د Nature.com لیدلو لپاره مننه.د براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).په ورته وخت کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ وړاندې کړو.
د سرطان حجرو مختلف میکانیزمونه رامینځته کړي ترڅو د سیلولر فشار باندې بریالي شي او پرمختګ ته دوام ورکړي.د پروټین کایناس R (PKR) او د دې پروټین فعال کونکي (PACT) لومړني ځواب ویونکي دي چې د فشار مختلف سیګنالونه څاري چې د حجرو د خپریدو او اپوپټوسس مخنیوي لامل کیږي.په هرصورت، د سرطان په حجرو کې د PACT-PKR لارې تنظیم په لویه کچه نامعلوم پاتې دی.دلته، موږ وموندله چې اوږد غیر کوډ RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) په مستقیم ډول د PACT-PKR لارې په مخنیوي کې دخیل دی او د سرطان حجرو خپریدو ته وده ورکوي.د CRISPRi 971 سرطان پورې تړلي lncRNA د لوی پیمانه فعال سکرینینګ کارولو سره، موږ وموندله چې DARS-AS1 د پام وړ د سرطان حجرو پراختیا سره تړاو درلود.له همدې امله، د DARS-AS1 ناک آوټ د حجرو د خپریدو مخه نیسي او په ویټرو کې د سرطان په مختلفو حجرو لاینونو کې د سرطان حجرې اپوپټوسس هڅوي او په ویوو کې د تومور وده د پام وړ کموي.په میخانیکي توګه، DARS-AS1 په مستقیم ډول د PACT فعالولو ډومین سره تړل کیږي او د PACT-PKR تعامل مخه نیسي، په دې توګه د PKR فعالیت، eIF2α فاسفوریلیشن، او د اپوپټوټیک حجرو مړینې مخنیوی کوي.په کلینیکي توګه، DARS-AS1 په ډیری سرطانونو کې په پراخه کچه څرګند شوی، او د دې lncRNA ډیر څرګندیدل د ضعیف تشخیص نښه ده.دا څیړنه د DARS-AS1 lncRNA لخوا د PACT-PKR لارې د سرطان ځانګړي مقررات روښانه کوي او د سرطان تشخیص او درملنې لپاره بل هدف چمتو کوي.
د فشار سره د تطابق وړتیا د سرطان د حجرو د بقا او پراختیا یوه مهمه ځانګړتیا ده.په سخت مایکرو چاپیریال کې د سرطان ګړندۍ خپریدو او میټابولیک نښه - د تغذیې کمښت ، هایپوکسیا ، او ټیټ pH - چې کولی شي د حجرو مړینې سیګنال لارې رامینځته کړي.د فشار حساس جینونو بې نظمۍ لکه p535، د تودوخې شاک پروټین 6, 7, KRAS8, 9, او HIF-110, 11, 12, 13 په مکرر ډول په سرطان کې لیدل کیږي، په دې توګه د اپوپټوسس مخنیوی کوي او د بقا وده کوي.
د پروټین کایناس R (PKR) یو مهم فشار سینسر او د یوکریوټیک ابتکار فکتور 2α (eIF2α) سبونیټ کایناس دی ، یو ژباړونکی تنظیم کونکی چې د سیلولر فشار د حجرو مړینې سره اړیکه لري.PKR په اصل کې د بهرني ډبل سټرینډډ RNA (dsRNA) په کشفولو سره د انټي ویرل پروټین په توګه پیژندل شوی و.په فعالولو سره، PKR فاسفوریلیټس eIF2α د ویروس او سیلولر پروټین ترکیب 14,15,16 مخنیوی کوي.PACT (PKR فعال پروټین) د dsRNA 17,18,19,20,21,22,23 په نشتوالي کې د لومړي PKR فعال پروټین په توګه پیژندل شوی.د PKR سره د مستقیم تعامل له لارې، PACT مختلف فشارونه (د سیروم لوږه، پیرو اکسایډ یا آرسینیټ درملنه) PKR او د لاندې سیګنال لارو لارو ته لیږدوي.د eIF2α فاسفوریلیشن سربیره، د PACT منځګړیتوب PKR فعالیت د فشار غبرګون سره تړلې مختلف پیښې رامینځته کوي، پشمول د PI3K/Akt24 لارې له لارې د ریډکس حالت بدلول، د p5325,26 او NF-κB27,28 له لارې د DNA د زیان معاینه کول او NF-κB27,28 لیږد تنظیموي. د فشار په ځواب کې د دوی مهم رول ته په پام سره، د خپریدو، اپوپټوسس او نورو کلیدي سیلولر پروسو، PKR او PACT د ډیری ناروغیو، په ځانګړې توګه د سرطان 30,31,32,33 لپاره د درملنې اهدافو ژمنې دي.په هرصورت، د دې pleiotropic فعال او بیولوژیکي اهمیت سره سره، د سرطان په حجرو کې د PACT/PKR فعالیت تنظیم کول پاتې دي.
lncRNAs د 200 نیوکلیوټایډونو څخه لوی نقلونه دي چې د پروټین کوډ کولو احتمال نلري.له هغه وخته چې د جینوم ترتیب کولو بشپړې پروژې په زرګونو lncRNAs پیژندلي، 35,36 د دوی د بیولوژیکي دندو روښانه کولو لپاره ډیرې هڅې شوي.د څیړنې یوې مخ پر ودې بدن ښودلې چې lncRNAs په ډیری بیولوژیکي پروسو کې دخیل دي په شمول د ایکس کروموزوم غیر فعال کولو تنظیم 38,39، امپرینټ40، لیږد 41,42، ژباړه43 او حتی د سرطان وده44,45,46,47.دې مطالعاتو راپور ورکړی چې ډیری lncRNAs د PACT/PKR لارې کې ښکیل دي.داسې یوې مطالعې ښودلې چې lncRNA ASPACT د PACT لیږد مخه نیسي او د PACT mRNA اټومي ساتل زیات کړي.نورو څیړنو ښودلې چې lncRNA nc886 PKR پورې تړلی او د فاسفوریلیشن 49,50 مخنیوی کوي.تر اوسه پورې، lncRNA د PACT منځګړیتوب PKR فعالیت تنظیموي راپور نه دی ورکړل شوی.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) د oncogenic lncRNA51,52,53,54 په توګه پیژندل شوی.د miP-194-5p53، miP-12952 او miP-532-3p51 د مقرراتو له لارې، DARS-AS1 په ترتیب سره د واضح حجرو رینل سیل کارسنوما، تایرایډ کارسنوما او غیر کوچني حجرو سږو کارسنوما وده ته وده ورکوي.ټانګ او همکارانو دا هم وموندله چې DARS-AS1 د پروټین 39 (RBM39) RNA- پابند شکل ثبات ساتلو سره د مایلوما پرمختګ ته وده ورکوي.په هرصورت، پدې اړه هیڅ مطالعه نه ده ترسره شوې چې ایا دا lncRNA د PACT-PKR فعالیت تنظیم کولو او د سرطان حجرو فشار غبرګون کې دخیل دی.
دلته، موږ د CRISPRi سیسټم په کارولو سره د لوی کچې د ضایع کولو فعالیت سکرین ترسره کړ او معلومه شوه چې DARS-AS1 lncRNA د سرطان د څو ډوله حجرو پراختیا ته وده ورکوي.سربیره پردې، موږ یو لوی میکانیزم پیژندلی دی: DARS-AS1 په مستقیم ډول د PACT سره تړل کیږي، د PACT او PKR پابندۍ مخنیوی کوي، د eIF2α فاسفوریلیشن مخه نیسي، د PKR ټیټ سبسټریټ، او په پای کې د اپوپټوټیک حجرو مړینې مخنیوی کوي.په پایله کې، زموږ کار DARS-AS1 lncRNA د PACT-PKR لارې تنظیم کونکي او د سرطان درملنې او تشخیص لپاره احتمالي هدف څرګندوي.
د جینومیک پروفایل کولو پراخه مطالعاتو په سلګونو lncRNAs پیژندلي چې د سرطان سره تړاو لري.په هرصورت، د دوی فعالیت په لویه کچه نامعلوم پاتې دی56.د سرطان په پرمختګ کې د ښکیل lncRNA نوماندانو پیژندلو لپاره، موږ د CRISPRi سیسټم (Fig. 1a) په کارولو سره د SW620 کولوریکټل سرطان حجرو لاین کې د کم خپریدو لپاره د ضایع کیدو فعالیت سکرین ترسره کړ.د SW480 او SW620 د کولمو سرطان حجرو لینونو ځانګړې ځانګړتیا دا ده چې دوی په یو ناروغ کې د لومړني او ثانوي تومورونو څخه اخیستل کیږي.دا د پرمختللي کولون سرطان په پرمختګ کې د جینیاتي بدلونونو مطالعې لپاره ارزښتناکه پرتله کوي.له همدې امله، موږ د RNA ترتیب کولو په کارولو سره د کولوریکټال سرطان حجرو لینونو (SW480 او SW620) ټرانسکریټومونه تحلیل کړل او د خپاره شوي ادبیاتو څخه ځینې احتمالي فعال lncRNAs راټول کړل.د دې پایلو پراساس، موږ د 7355 sgRNA oligos درلودونکي sgRNA کتابتون ډیزاین کړی چې د 971 سرطان سره تړلي lncRNAs او 500 غیر هدف شوي sgRNA oligos د منفي کنټرول لپاره په نښه کوي (اضافی ډاټا 1).
د CRISPRi سیسټم په کارولو سره د سکرینینګ سکیماتیک نمایش.b sgRNA بډایه کول د سکرینینګ وروسته.افقی نقطه شوی کرښه د log2 نمایش کوی (د فولډ بدلون) = ±0.58.عمودی نقطه کرښه د p ارزښت = 0.05 ښیي.تور ټکي د غیر هدف sgRNA استازیتوب کوي (د NC په توګه نومول شوی).سور ټکي sgRNAs دي چې DARS-AS1 په نښه کوي.نیلي نقطې sgRNAs دي چې LINC00205 په نښه کوي، چې مخکې تشریح شوي oncogenic lncRNA.د فولډ بدلون = (نورمال شوي لوستل، ورځ 17) / (نورمال شوي لوستل، ورځ 0).c DARS-AS1 sgRNA دستک د حجرو وده منع کوي.د تېروتنې بارونه د دریو تجربو ± معیاري انحراف څرګندوي.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 دوه مخي زده کونکي ټیسټ.د DARS-AS1 څرګندونه په تومورونو کې (TCGA ډیټاسیټ).د BLCA، KIRC، PRAD، LUSC، UCEC، LUAD، LIHC، KIRP، او COAD په ترتیب سره د ناروغانو څخه جوړه نورمال او تومور نمونو کې د DARS-AS1 څرګندونه (TCGA ډیټاسیټ).p-values ​​د جوړه شوي دوه پونډه زده کونکي ټ-ټیسټ په کارولو سره ترلاسه شوي.
د پلازمیډ جوړولو او د لینټیو ویروس بسته کولو وروسته، موږ د پورتني کتابتون سره د dCas9-SW620 کولوریکټال سرطان حجرو لاین په څلورو خپلواکو انتان تجربو کې انتقال کړ.د دې انتاناتو لپاره د انفیکشن ضرب (MOI) 0.1-0.3 و، دا په ګوته کوي چې هر حجره یوازې د یو sgRNA سره لیږدول کیدی شي.د ویټرو کلتور د 18 ورځو وروسته، د هدف sgRNAs بډایه کولو پروفایل د سکرینینګ وروسته کم یا زیات شو، پداسې حال کې چې د غیر هدف شوي کنټرول oligonucleotides شمیره د مخکینۍ سکرینینګ پروفایل په پرتله نسبتا بدله پاتې ده، دا په ګوته کوي چې زموږ هدف خورا لوړ سکرین لري. کتابتونوريجې.1b او ضمیمه جدول 1). LINC00205، چې مخکې د سږو سرطان او د ځيګر سرطان پرمختګ 58,59,60 ته وده ورکولو راپور ورکړل شوی و، د دې سکرینینګ اعتبار تاییدوي (لوګ 2 (فولډ چینج) < −0.58، p ارزښت <0.05)، د دې سکرینینګ اعتبار تاییدوي (انځور 1b). LINC00205، چې مخکې د سږو سرطان او د ځيګر سرطان پرمختګ 58,59,60 ته وده ورکولو راپور ورکړل شوی و، د دې سکرینینګ اعتبار تاییدوي (لوګ 2 (فولډ چینج) < −0.58، p ارزښت <0.05)، د دې سکرینینګ اعتبار تاییدوي (انځور 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1ب). LINC00205، مخکې د سږو سرطان او د ځيګر سرطان 58,59,60 پرمختګ ته وده ورکولو راپور ورکړی و، خارج شوی و (log2 (fold change) <-0.58، p-value <0.05)، د دې سکرینینګ پیاوړتیا تاییدوي (انځر. 1b) . د لینس 之前 报道 报道被 报道可 促进和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 肝癌 选 (يادښت () a 倍数 <0.05 (图 1b). د لینس 之前 报道 报道被 报道可 促进和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 肝癌 选 (يادښت () a 倍数 <0.05 (图 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1ب). LINC00205، مخکې له دې چې د سږو او ځيګر سرطان پرمختګ ته وده ورکړي 58,59,60، خارج شوی و (log2 (fold change) <-0.58، p-value <0.05)، د دې سکرینینګ پیاوړتیا تاییدوي (انځر. 1b).
د ټولو ازمویل شویو lncRNAs په منځ کې، DARS-AS1 هم وڅیړل شو، چې د 18 ورځو کلتور څخه وروسته درې پیژندونکي sgRNA oligonucleotides د پام وړ کم شوي، وړاندیز کوي چې د دې lncRNA بندیدل د سرطان د خپریدو د کمیدو لامل شوي (انځور 1b).دا پایله د کولوریکټل سرطان حجرو کې د MTS تحلیل لخوا نوره هم ملاتړ شوې چې ښیې چې د DARS-AS1 دستګاه حجرو د ودې کچه یوازې د کنټرول حجرو (شکل 1c) په پرتله نیمه وه او د سرطان د نورو ډولونو پخوانیو راپورونو سره مطابقت درلود.: روښانه د حجرو د پښتورګو سرطان، د تايرايډ سرطان او د وړو حجرو د سږو سرطان 51,52,53,55.په هرصورت، د کولوریکټل سرطان کې د هغې فعالیت او مالیکول میکانیزمونه ناڅاپه پاتې دي.له همدې امله، موږ دا lncRNA د نورو مطالعې لپاره غوره کړه.
په ناروغانو کې د DARS-AS1 بیان مطالعې لپاره، موږ د سرطان جینوم اتلس (TCGA) پروژې څخه د 10,327 تومور نمونې په بشپړه توګه تحلیل کړې.زموږ پایلې ښیې چې DARS-AS1 په پراخه کچه څرګند شوی او په صحي حجرو کې په مختلفو تومورونو کې د پام وړ لوړ شوی ، پشمول د کولون اډینوکارسینوما (COAD) ، د رینل کلیئر سیل کارسنوما (KIRC) ، او د رینل پاپیلري سیل کارسنوما (KIRP)..ډیر لږ (انځور 1d او اضافي شکل 1a، b). د جوړه شوي صحي/تومور نمونو تحلیل نور هم د مثانې urothelial کارسنوما (BLCA) په تومورونو کې د DARS-AS1 د پام وړ لوړ څرګندونه تایید کړه، د پښتورګو رینل کلیر سیل کارسنوما (KIRC)، پروستات اډینو کارسینوما (PRAD)، د سږو squamous cell carcinoma (LUSC) د رحم کورپس انډومیټریل کارسنوما (UCEC)، د سږو اډینوکارسینوما (LUAD)، د ځيګر هیپاټو سیلولر کارسنوما (LIHC)، د پښتورګو د پښتورګو پاپیلري سیل کارسنوما (KIRP)، او د کولمو اډینو کارسینوم (COAD) (p ارزښت <0.05) (شکل 1e) . د جوړه شوي صحي/تومور نمونو تحلیل نور هم د مثانې urothelial کارسنوما (BLCA) په تومورونو کې د DARS-AS1 د پام وړ لوړ څرګندونه تایید کړه، د پښتورګو رینل کلیر سیل کارسنوما (KIRC)، پروستات اډینو کارسینوما (PRAD)، د سږو squamous cell carcinoma (LUSC) د رحم کورپس انډومیټریل کارسنوما (UCEC)، د سږو اډینوکارسینوما (LUAD)، د ځيګر هیپاټو سیلولر کارسنوما (LIHC)، د پښتورګو د پښتورګو پاپیلري سیل کارسنوما (KIRP)، او د کولمو اډینو کارسینوم (COAD) (p ارزښت <0.05) (شکل 1e) .د جوړه شوي صحي/تومور نمونو تحلیل هم د مثانې urothelial کارسنوما (BLCA)، د کلین سیل رینل او رینل سیل کارسنوما (KIRC)، پروستات اډینو کارسینوم (PRAD)، د سږو squamous cell carcinoma (LUSC) تومورونو کې د DARS-AS1 د پام وړ لوړې څرګندونې تایید کړې., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , د کورپس uteri (UCEC) endometrial carcinoma، د سږو adenocarcinoma (LUAD)، د جگر hepatocellular carcinoma (LIHC)، د پښتورګو پاپیلري سیل کارسنوما (KIRP)، او د کولمو اډینو کارسینوم (COAD) (p ارزښت < 0.05) (انځور 1e-m).配对 健康 / 肿瘤样本肿瘤样本 的 证实 证实 da1 在 尿路 尿路 尿路 尿路 尿路 在 尿路 在 在皮癌 (BIR)، 前列 透明 (PARC)، 肺鳞状 透明 (PUSC) 肿瘤 (Lusc) 肿瘤a 高更 表达 表达، 子宫体子宫癌 (UCAC)، 肺腺癌 (LOHC)، 肝肝 细胞癌 细胞癌 (LIRP) 和结肠腺癌 (CARP) 和结肠腺癌 (CARP) 和结肠腺癌 (CAD) 和结肠腺癌 (CAD) <0.05）（图1e-m） .配配 健康 / 肿瘤样本肿瘤样本 的 的 dain-OS-OS OS1 在在尿路 上皮癌尿路 上皮癌 上皮癌 皮癌皮癌 皮癌皮癌 皮癌细胞癌 皮癌细胞癌 皮癌细胞癌 皮癌细胞癌 皮癌细胞癌 皮癌细胞癌 皮癌细胞癌 细胞癌细胞癌 皮癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌 细胞癌细胞癌细胞癌(lusc) 肿瘤肿瘤 的 的 的 的的 中中 中中 中中 中中 中癌 中癌 中癌 中癌 中癌 中 (Lucl) 肺腺癌 (لعن) 肝肝 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 (LICHC) 肾癌 (kirp) （coad） (p 值<0.05））） (图1e-m）).د صحي/تومور جوړه نمونو تحلیل نور د مثانې urothelial کارسنوما (BLCA)، د کلین سیل رینل سیل کارسنوما (KIRC)، پروستات اډینوکارسینوما (PRAD)، او د سږو squamous cell carcinoma (LUSC) تومورونو کې د DARS-AS1 رول نور هم ملاتړ کړی.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). د کورپس uterine کارسنوما (UCEC)، د سږو اډینوکارسینوما (LUAD)، hepatocellular carcinoma (LIHC)، د رینل پاپیلري سیل کارسنوما (KIRP)، او کولن اډینوکارسینوما (COAD) (p ارزښت <0.05) (شکل 1e -m).یوځای اخیستل شوي، دا پایلې ښیي چې DARS-AS1 په مختلفو سرطانونو کې په پراخه کچه او خورا څرګند شوي.
ځکه چې DARS-AS1 او DARS (د انټي سینس سټرینډ کوډ کولو جین) ورته پروموټر شریکوي او یو بل ته نږدې موقعیت لري، موږ shRNA ډیزاین کړی ترڅو په ځانګړي ډول DARS-AS1 ټک کړي مګر DARS نه (اضافی شکل 2a،b او ضمیمه جدول 2) .د SW620 برسیره، موږ درې نور حجرې لاینونه هم کارولي چې د DARS-AS1 څرګندونه کوي ترڅو د shRNA دستک کولو اغیزمنتیا او فعالیت مطالعه کړي (اضافی جدول 3).زموږ پایلې ښیي چې ټول درې shRNAs رامینځته شوي لږ تر لږه 80٪ DARS-AS1 دستک موثریت ترلاسه کړی چې د DARS mRNA مقدار باندې لږ تاثیر لري (اضافي شکل. 2c-f).برسېره پردې، موږ وموندله چې د دې shRNAs سره DARS-AS1 د پام وړ د کولوریکټال سرطان حجرو لاینونو SW620 (49.7٪) او HCT116 (27.7٪)، د سینې سرطان حجرې لاین MBA-MD-231 (53.4٪) کې د حجرو وده د پام وړ مخنیوی کوي.) او د HepG2 د هیپاټوما حجرو لاین (92.7٪ کمښت)، او همدارنګه د دوی وړتیا چې د غیر منحل شوي ساحې رامینځته کړي (د ~ 50.8٪ اوسط کمښت، 44.6٪، 40.7٪ او 75.7٪ د هر حجرې کرښه) (انځور 2a،b).په SW620 کې، د کالونی جوړونې ارزونې پایلې نوره هم تایید کړه چې DARS-AS1 shRNA د پام وړ د حجرو د خپریدو مخه نیسي چې په اوسط ډول نږدې 69.6٪ کمښت لري (انځور 2c).
په SW620، HCT116، MBA-MD-231، او HepG2 حجرو کې د حجرو د خپریدو په اړه د shRNA او DARS-AS1 shRNA کنټرول اغیزې (a) او د سپیرایډ جوړښت (b) کې.c د کنټرول shRNA او DARS-AS1 shRNA اغیزې په SW620 حجرو کې د کالونی جوړښت باندې.د حجرو خپریدل (d)، د سپیرایډ جوړښت (e)، او د SW620 حجرو د کالونی جوړښت (f) د DARS-AS1 څخه ډیر څرګندیږي.ښودل شوي معلومات د دریو تجربو اوسط ± معیاري انحراف دی.* p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01، او *** p ≤ 0.001 د دوه ګونی زده کونکي د ټیسټ لخوا.
د فعالیت له لاسه ورکولو مطالعاتو بشپړولو لپاره، موږ بیا د SW620 حجرې جوړې کړې چې د DARS-AS1 (اضافي شکل. 2g) څخه ډیر فشار لري.DARS-AS1 overexpression د پام وړ د حجرو وده (1.8-fold) زیاته کړه، په SW620 حجرو کې د غیر منظم سپیرایډ جوړښت (1.4-fold)، او د کالونی جوړښت (3.3-fold) (انځور 2d-f).موږ دا پایله د بل DARS-AS1 څرګندونکي سیل لاین ، A549 په کارولو سره تایید کړه.د DARS-AS1 د زیاتوالي له امله د حجرو دا وده شوې وده په A549 حجرو کې نور هم لیدل شوې (اضافي شکل. 2h، i او ضمیمه جدول 3).په ګډه اخیستل شوي، دا لاسته راوړنې او زیان مطالعات ښیي چې DARS-AS1 په ویټرو کې د سرطان حجرو پراختیا ته وده ورکوي.
د اصلي میکانیزم سپړلو لپاره چې له مخې DARS-AS1 د حجرو خپریدل تنظیموي، موږ د RNA پل-ډاون تحلیل ترسره کړ ترڅو د دې احتمالي پروټین پابند شریکان وپیژني.د RT-qPCR پایلو ښودلې چې د DARS-AS1 شاوخوا 86.2٪ د SW620 حجرو په سایتوپلازم کې موقعیت لري (اضافي شکل. 3a).په ان ویټرو کې لیکل شوی بایوټینیل شوی DARS-AS1 یا pseudoRNA بیا د SW620 سیل لیسټس سره انکیوب شوی و چې وروسته د SDS-PAGE جلا کول.وروسته د سپینو زرو داغ وښودله چې یو ځانګړی بانډ (~ 38 kDa) د DARS-AS1 پل نمونو کې د پام وړ بډایه شوی مګر په ډمي RNA یا د مچیو نمونو کې ندي (انځور 3a).دا بانډ د ډله ایز سپیکرومیټری (MS) لخوا د PKR فعال پروټین (PACT) په توګه پیژندل شوی او نور په SW620، HCT116، او HepG2 حجرو لاینونو (انځور.د DARS او اړوند PACT پروټینونو بډایه کول - PKR او TRBP - د لویدیځ بلاټینګ (WB) لخوا د RNA تحلیل په کارولو سره هم څیړل شوي.پایلو ښودلې چې د DARS-AS1 RNA او د دې دریو پروټینونو ترمینځ هیڅ مستقیم تعامل ندی موندل شوی (اضافی شکل 3b).د DARS-AS1 او PACT ترمنځ مشخص تعامل د RNA امونپریسیپیټیشن (RIP) تحلیل لخوا نور هم تایید شوی، کوم چې ښودلې چې DARS-AS1 د PACT ضد انټي باډیزونو کې د پام وړ بډایه شوی مګر نور کنټرول RNAs (شکل 3c) نه.د دې معلومولو لپاره چې ایا DARS-AS1 د نورو سیلولر اجزاو په نشتوالي کې د PACT سره مستقیم تعامل کوي ، د پاک شوي PACT په کارولو سره د ان ویټرو بایلویر انټرفیرومیټري (BLI) معاینه ترسره شوې.د بایوټین لیبل شوی DARS-AS1 یا ډمي RNA په streptavidin (SA) بایوسینسرونو کې متحرک شوی او بیا د 1 μM PACT لرونکی کاینټیک بفر کې انکیوب شوی.د پام وړ، PACT په کلکه د DARS-AS1 (KD ارزښت ~ 26.9 nM) پورې تړلی دی، مګر د RNA (شکل 3d) نقل کولو لپاره نه.یوځای اخیستل شوي، دا پایلې د DARS-AS1 او PACT ترمنځ مستقیم تعامل او لوړ تړاو څرګندوي.
د RNA پل تحلیل DARS-AS1 په SW620 حجرو کې د PACT سره متقابل عمل پیژندلی.پورته، د اړوندو پروټینونو د سپینو زرو داغ.د PACT ضد انټي باډي سره د ټيټ امونابلاټس ترسره شوي.د RNA پل-ډاون تحلیل په HCT116 (پورته) او HepG2 (لاندې) حجرو کې ترسره شوی.د PACT غني کول د امونوبلوټینګ لخوا کشف شوي.د CRNA امونپریسیپیټیشن (RIP) معاینات په SW620 حجرو کې د اشاره شوي انټي باډونو په کارولو سره ترسره شوي.d د بشپړ اوږدوالي DARS-AS1 یا کنټرول RNA ته د PACT پابند منحني د بایولایر انټرفیرومیټري (BLI) په کارولو سره ترلاسه شوي.RNA په سټریپټاویډین بایوسینسر کې متحرک شوی و.1 μM PACT د اتحادیې اندازه کولو لپاره کارول شوی و.د RNA پل انسټاګرام د بایوټینیلډ بشپړ اوږدوالی DARS-AS1 یا ټیټ شوي (پورته) په کارولو سره ترسره شو.Immunoblot ښيي چې PACT ترلاسه شوی (لاندې).f پاک شوی بیرغ شوی PACT د بایوټینیلیډ بشپړ اوږدوالی DARS-AS1 سره مینځل شوی یا د ویټرو RIP امتحان لپاره (لکه په e کې) ټوټه شوی.استخراج شوی RNA د RT-qPCR لخوا تایید شوی.g د PACT لپاره د مختلف RNA ټوټو نسبي تړاو د بایلویر انټرفیرومیټري په کارولو سره ترلاسه شوی.د تحلیل لپاره، 100 nM RNA او 1 μM RAST کارول شوي.h په ویټرو کې RIP معاینې د پاک شوي پاتې یا قطع شوي لیبل شوي PACT په کارولو سره ترسره شوي.استخراج شوی RNA د RT-qPCR لخوا تایید شوی.د SW620 حجرو د ودې کچه چې د DARS-AS1، PACT، یا دواړو څخه ډیر څرګندیږي.j په SW620 حجرو کې د بشپړ اوږدوالي یا قطع شوي DARS-AS1 ډیر څرګندیدل د حجرو په وده مختلف اغیزې درلودې.k اپوپټوسس د PARP ضد انټي باډي سره د امونوبلوټینګ لخوا کشف شوی.l د DARS-AS1 ناک آوټ د SW620 حجرو اپوپټوسس هڅوي لکه څنګه چې د فلو سایټومیټري لخوا ښودل شوي.ښودل شوي معلومات د دریو تجربو اوسط ± معیاري انحراف دی. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p < 0.0001، د دوه لکۍ زده کونکي د ټیسټ په واسطه. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p < 0.0001، د دوه لکۍ زده کونکي د ټیسټ په واسطه. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p < 0.0001 د دوه لکۍ زده کونکي د ټیسټ ازموینې لخوا. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001، 通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001، 通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05، **p ≤ 0,01، ***p ≤ 0,001، ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p < 0.0001 د دوه لکۍ زده کونکي د ټیسټ ازموینې لخوا.
بیا موږ د ویټرو لیږد په واسطه درې بایوټینیل شوي DARS-AS1 RNA ټوټې رامینځته کړې ترڅو د PACT اتحادیې لپاره اړین DARS-AS1 سیمه وپیژني (شکل 3e).د RNA تحلیل پایلې وښودله چې هره ټوټه د PACT سره د تعامل توان درلود، مګر د 3′-ترمینل سیمه (384-768 نیوکلیوټایډونه چې A3 لیبل شوي) د 1-384 نیوکلیوټایډونو څخه ډیر ښودلي چې A1 لیبل شوي) (3e انځور).ورته پایلې د recombinant PACT (شکل 3f) په کارولو سره د ویټرو RIP ارزونې کې لیدل شوي.د دې پایلو سره په مطابقت کې، د BLI په کارولو سره PACT ته د غیر متحرک RNA ټوټې تړلو تجربو دا هم ښودلې چې PACT د A3 (384-768 nt) (د نږدې 94.6 nM KD ارزښت) سره لوړ تړاو لري، پداسې حال کې چې نږدې د نورو سیمو سره هیڅ اړیکه نلري.(انځور 3d).
موږ په PACT کې اړونده پابند سیمې هم معاینه کړې.PACT درې فعاله ډومینونه لري، چې دوه یې د ډبل سټنډ شوي RNA- پابند ډومینونه (dsRBD) او دریم ډومین (د D3 نومول شوی) ساتل شوي چې د پروټین تعاملاتو د فعالولو په توګه کار کوي.د هر ډومین د lncRNA پابند ظرفیت معاینه کولو لپاره، موږ درې تغیرات انجینر کړل چې د دریو ډومینونو څخه هر یو یې لرې کړل او د ویټرو RIP ارزونه یې ترسره کړه.زموږ پایلو وښودله چې د PACT دریم ډومین (D3) له مینځه وړل د DARS-AS1 سره د پام وړ متقابل عمل کم کړی (د پاتې PACT په پرتله د 0.11-fold لخوا) د نورو دوه بدلونونو (Fig. 3h) په پرتله ، دا وښودل شوه چې خوشې کول د D3 څخه د DARS سره اړیکه لري.-AC1.په ګډه اخیستل شوي، دا پایلې وړاندیز کوي چې د DARS-AS1 او PACT ترمنځ تعامل ممکن په ابتدايي توګه د DARS-AS1 د 3 پای پای او د PACT د D3 ډومین له لارې واقع شي.
موږ یادونه وکړه چې DARS-AS1 د PACT په بیان باندې هیڅ اغیزه نه درلوده او PACT په DARS-AS1 باندې هیڅ اغیزه نلري (اضافی شکل. 3c).موږ بیا د حجرو وده باندې د PACT دستک کولو اغیز معاینه کړ.د DARS-AS1 په مقابل کې، نسبي حجرې 1.5-3 ځله ګړندۍ وده کړې کله چې PACT وتړل شو (اضافي شکل. 3d).د کالوني جوړونې د ارزونې پایلې په ګوته کوي چې حجرې د PACT (اضافي شکل 3e) سره د shRNA درملنې وروسته له 2-3-fold کالونۍ رامینځته کوي.د دې معاینې لپاره چې ایا DARS-AS1 د PACT له لارې د حجرو خپریدل تنظیموي، موږ د SW620 حجرې رامینځته کړې چې د PACT، DARS-AS1، یا دواړه څخه ډیر تاثیر کوي.د PACT ډیر څرګندیدل د حجرو د خپریدو د پام وړ مخنیوی ښودلی (شکل 3i).پداسې حال کې چې د DARS-AS1 overexpression په هره برخه کې د پام وړ د حجرو خپریدو ته وده ورکوي، د DARS-AS1 او PACT څخه ډیر د حجرو د ودې په کچه کې کوم مهم توپیر شتون نلري.دا پایلې وړاندیز کوي چې PACT کیدای شي د DARS-AS1 ډیر فشار له امله رامینځته شوي زیاتوالي سره مبارزه وکړي.
څرنګه چې د DARS-AS1 مختلف سیمې د PACT- پابند کولو مختلف وړتیاوې لري، موږ د DARS-AS1 ټوټو د مختلف زیاتوالي لخوا د حجرو په خپریدو باندې د دوی نسبي نفوذ تحقیق کړی.د نورو دوو برخو په پرتله، DARS-AS1 په 3′ پای (384-768 nt) کې ډیر فشار درلود، په DARS-AS1 کې د PACT پورې اړوند اصلي سیمه، کوم چې د حجرو د خپریدو د هڅولو لوړ وړتیا درلوده (انځور 3j).دا پایلې د DARS-AS1 د پابند ظرفیت او بیولوژیکي فعالیت تر مینځ مثبت اړیکه په ګوته کوي.
PACT د پرو اپوپټوټیک پروټین 19 راپور شوی.له همدې امله، موږ د اپوپټوسس په اړه د DARS-AS1 اغیزې څیړلې.لکه څنګه چې تمه کیده، د DARS-AS1 دستګاه د پام وړ د SW620 حجرو کې د PARP تخریب زیات کړی او په SW620، HCT116، HepG2، او MBA-MD-231 حجرو لینونو کې د انیکسین V-مثبت حجرو تناسب زیات کړی (انځور 3k).۳).3f–h)، دا په ګوته کوي چې د سرطان په حجرو کې د DARS-AS1 ضد اپوپټوټیک اغیز د PACT د اپوپټوسیس هڅوونکي فعالیت سره مخالف دی.یوځای اخیستل شوي، دا پایلې وړاندیز کوي چې د DARS-AS1 oncogenic فعالیت میکانیزم ممکن د PACT فعالیت مخنیوی له لارې وي.
بیا، موږ د DARS-AS1-PACT اتحادیې فعالې اغیزې وپلټلې.PACT راپور شوي چې د مستقیم تعامل له لارې PKR فعالوي، کوم چې وروسته د eIF2α فاسفوریلیشن ته وده ورکوي، چې د ژباړې له مینځه وړل او apoptosis17 المل کیږي.لومړی، موږ معاینه کړه چې آیا DARS-AS1 د PACT او PKR سیلولر ځایی کولو اغیزه کوي.Confocal fluorescence microscopy وښودله چې PACT او PKR په SW620 حجرو کې د 0.72 په اوسط ډول د پییرسن ارتباط کوټ سره په لوړه کچه راټول شوي.په ورته وخت کې، د DARS-AS1 اوور ایکسپریشن د پام وړ د PACT او PKR شریک ځایی کول کم کړي (په دې معنی چې د پییرسن ارتباط کوفیشین 0.61) (شکل 4a).د دې تحقیق کولو لپاره چې ایا DARS-AS1 کولی شي د PACT-PKR تعامل تعدیل کړي، موږ د SW620 سیل لیسټس کې د PACT ضد انټي باډي سره د Co-immunoprecipitation (co-IP) معاینه ترسره کړه.PKR د کنټرول په حجرو کې د PACT ضد کې خورا بډایه شوی و، پداسې حال کې چې د PKR بیا رغونه د DARS-AS1 (انځور 4b) څخه د زیات فشار لرونکي حجرو څخه په لیسټس کې د پام وړ کمه شوې وه.پاک شوي لیبل شوي PACT او PKR د ویټرو پروټین پابندۍ ارزونو لپاره کارول شوي.په دې اساس، هغه کسان چې DARS-AS1 چمتو کړي مګر هیڅ کنټرول RNA د PACT-PKR تعامل فشار نه ښودلی (شکل 4c).ټولو پایلو ښودلې چې DARS-AS1 د PACT او PKR ارتباط ګډوډ کړی.
د کنټرول حجرو یا حجرو کې د PACT او PKR ګډ ځایی کول د DARS-AS1 څخه ډیر فشار لرونکي حجرې د کنفوکل فلوروسینس مایکروسکوپي په کارولو سره لیدل شوي.نیوکلی د DAPI سره داغ شوی و.احصایوي پایلې د 16 عکسونو څخه ترلاسه شوي.b Co-immunoprecipitation (co-IP) د کنټرول SW620 حجرو یا حجرو د DARS-AS1 څخه ډیر فشار لرونکي حجرو کې د PACT ضد انټي باډي په کارولو سره.c لیبل شوی PACT، پاک شوی PKR او د DARS-AS1 یا موک RNA سره په ویټرو کې لیکل شوي د ویټرو پروټین پابند تحلیل لپاره انکیوبیټ شوي.د بیرغ ضد انټي باډي د معافیت لپاره کارول شوي.d د اشاره شوي انټي باډي سره امیونوبلوټونه په SW620 او HCT116 حجرو کې ترسره شوي چې د کنټرول shRNA یا DARS-AS1-shRNA سره لیږدول شوي او د سیرم لوږې تعقیب شوي.د DARS-AS1 بیان کچه د تاپسیګارګین لپاره د سیلولر حساسیت بدل کړی.د SW620 حجرې د DARS-AS1 shRNA، DARS-AS1 overexpression پلاسمیډ یا کنټرول پلازمیډ سره لیږدول شوي.حجرې د تاپسیګارګین سره د 48 ساعتونو لپاره درملنه شوې او د MTS ریجنټ په کارولو سره د حجرو وړتیا ټاکل شوې.f په ویټرو کې لیکل شوي DARS-AS1 یا ډمي RNA او پاک شوي PACT د ویټرو فعالولو ارزونې او امیونو بلاټ کشف لپاره کارول شوي.g د دې انټي باډونو په کارولو سره امیونو بلاټس د SW620-ctrl حجرو (کیڼ اړخ) یا حجرو کې چې د PKR میوټینټ (ښي) څخه ډیر څرګندیږي ترسره شوي.دا حجرې بیا د کنټرول shRNA یا DARS-AS1-shRNA سره لیږدول شوي چې د سیرم لوږې تعقیب شوي.h فلو سیټومیټري ښودلې چې د متغیر PKR غیر فعال کول په SW620 حجرو کې د DARS-AS1- induced apoptosis لپاره تاوان ورکوي.i Immunoblots د نښه شوي انټي باډي سره په SW620 (کیڼ لور) یا HCT116 (ښي) حجرو کې ترسره شوي.هغه حجرې چې د کنټرول shRNA یا DARS-AS1 shRNA سره لیږدول شوي د سیرم څخه محروم دي او د 100 nM PKR C16 مخنیوی یا DMSO سره ضمیمه کیږي.سکیل بار = 5 µm.ښودل شوي معلومات د دریو تجربو اوسط ± معیاري انحراف دی.* p ≤ 0.05 دوه مخي زده کونکي ټیسټ.
عموما داسې انګیرل کیږي چې کله PACT د PKR17 سره اړیکه ونیسي، په Thr451 کې PKR فاسفوریلیشن هڅول کیدی شي.زموږ پایلو ښودلې چې د PKR فاسفوریلیشن کچه د سیروم لوږې وروسته د DARS-AS1 دستک کولو حجرو کې د پام وړ لوړه شوې وه (انځور 4d او اضافي شکل 4a).په همدې اساس، موږ وموندله چې د eIF2α فاسفوریلیشن، د PKR اصلي سبسټریټ، د DARS-AS1 shRNA (انځور 4d او اضافي شکل 4a) لخوا هم د پام وړ زیاتوالی موندلی.تاپسیګارګین د ER فشار راوړونکی دی چې د ER د Ca2+ خوشې کیدو لامل کیږي.د تاپسیګارګین درملنه د PACT بیان او فعالولو لپاره راپور شوي، کوم چې نور د PKR سره اړیکه لري او فعالوي، چې د eIF2α فاسفوریلیشن 18,61 زیاتولو سره د اپوپټوسس المل کیږي.دلته، موږ تاپسیګارګین د PACT/PKR لارې د محرک په توګه کارولی ترڅو وڅیړي چې ایا DARS-AS1 کولی شي د حجرو سره مرسته وکړي د PACT/PKR لارې په مخنیوي سره فشار باندې بریالي شي.موږ ولیدل چې د DARS-AS1 بیان کچه په مثبت ډول د تاپسیګارګین سره د حجرو مقاومت سره تړاو لري.د SW620 حجرې چې د DARS-AS1 څخه ډیر تاثیر کوي ښه ژوندي پاتې شوي کله چې د تاپسیګارګین درملنه کیږي، پداسې حال کې چې د DARS-AS1 د بندیدو سره حجرې ډیر حساس شوي (انځور 4e).د دې پایلو سره په مطابقت کې، DARS-AS1 overexpression د تاپسیګارګین هڅول شوي PKR فاسفوریلیشن کم کړی (اضافی شکل. 4b).په مقابل کې، د تاپسیګرګین درملنې وروسته، PKR او eIF2α د کنټرول حجرو په پرتله د DARS-AS1 دستګاه حجرو کې په لوړه کچه فاسفوریلیټ شوي (اضافی شکل. 4b).په زړه پورې خبره دا ده چې تاپسیګارګین د DARS-AS1 څرګندونه په دوز پورې تړلي ډول رامینځته کړې ، کوم چې ممکن د DARS-AS1 د فشار ضد فعالیت په ګوته کړي (اضافی شکل 4c).سربیره پردې ، موږ د دې لیدونو تصدیق کولو لپاره د ویټرو فعالولو ارزونه ترسره کړه.په لنډه توګه، PKR د PKR ضد انټي باډي په کارولو سره د سیل لیسټس څخه پاک شوی، بیا د بیا جوړونکي PACT او DARS-AS1 سره په ویټرو کې لیکل شوی.د انزیماتیک غبرګون وروسته، فاسفو-PKR د WB په کارولو سره کشف شو.زموږ پایلو ښودلې چې د PKR فاسفوریلیشن د پام وړ د DARS-AS1 لخوا منع شوی، مګر د کنټرول RNA لخوا نه (شکل 4f).دا په ویټرو او د ویوو پایلې وړاندیز کوي چې DARS-AS1 د PACT منځګړیتوب PKR فعالیت منع کوي.په ورته وخت کې، موږ د DARS-AS1 (شکل 4f) په شتون کې د PACT بیا رغونه کې کمښت هم ولید.دا پایله د ویټرو پروټین بائنډینګ ازموینې پایلو سره مطابقت لري (شکل 4c) او بیا د PACT-PKR اتحادیې لپاره د DARS-AS1 بلاک کولو فعالیت روښانه کوي.
د PACT په D3 ډومین کې Ser246 او Ser287 د سیلولر فشار لاندې د PKR فعالولو لپاره اړین دي.د الانین لپاره د دوه سیرین پاتې شونو ځای په ځای کولو متوازی PACT (mutD) ورکړ، کوم چې د فشار په نشتوالي کې PKR فعال کړ، او د الانین (mutA) ځای په ځای کولو پروتوکول بدل کړ.له هغه وخته چې موږ د دې ډومین اهمیت د DARS-AS1 سره په مستقیمه اړیکه کې ښودلی، موږ دا دوه PACT متغیرات تولید کړي ترڅو دا ازموینه وکړي چې ایا دا پاتې شونه هم د DARS-AS1 سره په تعامل کې دخیل کیدی شي.په زړه پورې خبره دا ده چې دواړو متقابلو د DARS-AS1 سره د تړلو وړتیا له لاسه ورکړه (اضافی شکل 4d)، وړاندیز کوي چې د PACT پروټین بشپړ جوړښت ممکن د DARS-AS1 سره د اغیزمن تعامل لپاره اړین وي.
سربیره پردې، زموږ پایلې دا هم وړاندیز کوي چې DARS-AS1-shRNA-د حجرو د خپریدو مخنیوی د غالب منفي PACT میوټینټ (PACTmutA) یا غالب منفي PKR میوټینټ (PKRmut) (اضافي شکل 4e. e) د ډیر فشار په واسطه په جزوي توګه بحال کیدی شي.د غالب-منفي PKR متقابلو زیاتوالی د PKR فاسفوریلیشن کم کړی چې د DARS-AS1 دستک او همدارنګه د سیرم بې برخې حجرو کې eIF2α فاسفوریلیشن لخوا هڅول شوی (انځور 4g).تر ټولو مهم، د اپوپټوټیک حجرو تناسب چې د DARS-AS1 دستګاه لخوا هڅول شوي هم په حجرو کې د PKRmut څخه ډیر فشار کم شوی (انځور 4h او اضافي شکل. 4g).د PKR kinase فعالیت منع کول د DARS-AS1 فعالیت هم زیانمنوي، لکه څنګه چې پایلې ښودلې چې د DARS-AS1 دستګاه په ندرت سره PKR او eIF2α فاسفوریلیشن رامینځته کوي کله چې حجرې د PKR ځانګړي C16 مخنیوی کونکي (انځور 4i او ضمیمه 4) سره درملنه کیږي.).په ګډه اخیستل شوي، زموږ پایلې وړاندیز کوي چې DARS-AS1 د حجرو پراختیا ته وده ورکوي، لږترلږه په یوه برخه کې، د PACT منځګړیتوب PKR فعالیت منع کولو سره.
په تومورجنیسیس کې د DARS-AS1 رول نور سپړلو لپاره، موږ د ماوس xenograft ماډل په کارولو سره د vivo تجربو کې ترسره کړل. پایلې ښیي چې د DARS-AS1 ټکولو په موږکانو کې د تومور وده په ډراماتیک ډول کمه کړې (د p ارزښت <0.0001) (انځور 5a). پایلې ښیي چې د DARS-AS1 ټکولو په موږکانو کې د تومور وده په ډراماتیک ډول کمه کړې (د p ارزښت <0.0001) (انځور 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). پایلې ښیي چې د DARS-AS1 دستګاه په موږکانو کې د تومور وده په پراخه کچه کموي (p ارزښت <0.0001) (شکل 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值<0.0001）（图5a）.结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）. Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). پایلو وښودله چې د DARS-AS1 ټکولو په موږکانو کې د تومور وده د پام وړ کمه کړې (p ارزښت <0.0001) (شکل 5a).په دې توګه، د DARS-AS1 دستګاه ګروپ کې، د تومور په اوسط حجم کې شاوخوا 72.9٪ او د تومور ډله شاوخوا 87.8٪ (انځور 5b-d) کې د پام وړ کمښت شتون درلود.دا پایلې په کلکه وړاندیز کوي چې DARS-AS1 کولی شي په ویوو کې د تومور وده د پام وړ وده وکړي.
په نریو موږکانو کې د کولوریکټل آنکوجینیزس باندې د DARS-AS1 د ټکولو اغیزې.د ودې منحني (a)، د تومور اندازه (b)، وزن (c)، او د تومور انځورونه (d) ښودل شوي.د تېروتنې بارونه ± SEM استازیتوب کوي. n = 10. ****p < 0.0001، د دوه لکۍ زده کونکي د ټیسټ په واسطه. n = 10. ****p < 0.0001، د دوه لکۍ زده کونکي د ټیسټ په واسطه. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 دوه مخی زده کونکي ټیسټ.n = 10. ****p <0.0001، 通过双尾学生检验. ****p <0.0001، 通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 دوه مخی د زده کونکو ټیسټ ازموینه.e Kaplan-Meier د UVM، KICH، KIRP، MESO، GBM، او LGG سره په ناروغانو کې د DARS-AS1 بیان کچې او د ټولیز بقا ترمنځ ارتباط تحلیل کړ.په ناروغانو کې د DARS-AS1 څرګندونې لوړې کچې 50٪ کې وې؛په ناروغانو کې د DARS-AS1 بیان ټیټه کچه په 50٪ کې وه.p-values ​​د لوګ رتبې ازموینې په کارولو سره ټاکل شوي.f وړاندیز شوی ماډل په کوم کې چې DARS-AS1 د PACT-PKR لاره او د تومور وده تنظیموي.
د DARS-AS1 د کلینیکي اغیزې د ښه پوهیدو لپاره، موږ د هغې د بیان او د ناروغ بقا تر منځ اړیکه معاینه کړه.د TCGA ډیټاسیټ تحلیل کولو سره، موږ وموندله چې د DARS-AS1 لوړ بیان د uveal melanoma (UVM)، د رینل کروموفوبیا (KICH)، د رینل پیپلیري سیل کارسنوما (KIRP)، میسوتیلیوما (MESO)، ملټي پلیکس سره تړاو درلود.ټیټ ژوندي پاتې کیدل د پام وړ د ګلیوبلاستوما مورفوسیس (GBM) او ناروغانو سره د ټیټ درجې دماغ ګلیوما (LGG) (شکل 5e) سره تړاو درلود.دا پایلې وړاندیز کوي چې DARS-AS1 ممکن د کلینیکي تومور پرمختګ کې مهم رول ولوبوي او ممکن په ډیری سرطانونو کې احتمالي وړاندوینې بایو مارکر وي.
په دې څیړنه کې، د لوی پیمانه CRISPRi فعال سکرینینګ په کارولو سره، موږ معلومه کړه چې DARS-AS1 lncRNA د دوه کلیدي فشار ځواب ورکوونکو، PACT او PKR تنظیم کولو سره د سرطان د حجرو فشار باندې بریالي کیږي.د PACT سره مستقیم تعامل کولو سره، DARS-AS1 د PACT منځګړیتوب PKR فعالیت مخنیوی کوي، په دې توګه د اپوپټوټیک حجرو مړینې مخه نیسي او د حجرو پراختیا ته وده ورکوي (Fig. 5f).د DARS-AS1 لوړول د سرطان په ډیری ډولونو کې لیدل شوي، دا وړاندیز کوي چې د فشار لرونکي شرایطو لاندې د سرطان حجرو بقا ته وده ورکولو فعالیت ممکن د سرطان په ډیری ډولونو کې په پراخه کچه تطبیق شي.
PACT د PKR فعال پروټین په توګه پیژندل شوی، او د PACT منځګړیتوب PKR فعالول د لیږد، ژباړې، اپوپټوسس، او نورو مهمو سیلولر پروسو تنظیم کولو له الرې د فشار په غبرګون کې مهم رول لوبوي.د لسیزو راهیسې، د PACT-PKR cascade د سرطان ځانګړي مقرراتو پوهیدو لپاره هڅې شوي.دلته، زموږ مطالعې د سیلولر lncRNA DARS-AS1 له لارې د سرطان په حجرو کې د PACT-PKR تنظیم کولو مختلف میکانیزم په ګوته کړ، کوم چې په مستقیم ډول د PACT سره تړاو لري، د PACT-PKR تعامل بندوي، د PKR فعالیت او eIF2α فاسفوریلیشن منع کوي، په دې توګه د فشار هڅول او اپوټوسس مخنیوی کوي. د وروستي سرطان خپریدو هڅول.حجرېدا موندنه د سرطان د تشخیص او درملنې لپاره د احتمالي lncRNA اهدافو باندې رڼا اچوي.
زموږ معلوماتو ښودلې چې د DARS-AS1 دستک د فاسفوریلیټ PKR او eIF2α کې د پام وړ زیاتوالي سره حجرې د سیروم لوږې ته حساس کوي.دا پایلې وړاندیز کوي چې DARS-AS1 د PACT/PKR فعالیت منع کولو سره په سختو شرایطو کې د سرطان حجرو بقا هڅوي.یو شمیر نور غیر کوډینګ RNAs لکه ASPACT او nc886 هم د PACT/PKR په محور کې د PACT48 mRNA کمولو یا د PKR49,50,64 سره پابند کولو سره د آټو فاسفوریلیشن تنظیم کولو سره دخیل دي.د دوی په منځ کې، DARS-AS1 د PACT-PKR اتحادیې د ګډوډونکي په توګه کار کوي.دا څیړنه د PACT/PKR محور مقرراتو او د فشار په ځوابونو کې د lncRNAs رول په اړه زموږ پوهه بډایه کوي.
PACT درې جلا ډومینونه لري.د لومړي دوه dsRBDs څخه هر یو د PACT سره د PKR سره د لوړې اړیکې پابندۍ ترلاسه کولو لپاره کافي دي ، پداسې حال کې چې دریم ډومین (D3) په ویټرو او vivo کې د PKR فعالولو لپاره اړین دی.زموږ مطالعې ښودلې چې DARS-AS1 په غوره توګه د D3 ډومین سره اړیکه لري (انځور 3h).د lncRNA (768 نیوکلیوټایډونو) لوی اندازې ته په پام سره، DARS-AS1 د D3 پابند کول کولی شي په فزیکي توګه د PACT ډومین dsRBD او PKR ترمنځ تعامل منع کړي، په دې توګه د PACT او PKR اتحادیه بندوي.د PACT نقطې بدلونونه چې د Ser246 او Ser287 په D3 کې د الانین یا اسپارټیټ سره ځای په ځای شوي د DARS-AS1 لپاره د هغې پابند تړاو ګډوډوي، د دوی په اتحادیه کې د D3 عمومي ساختماني او بریښنایی ملکیتونو اهمیت ته اشاره کوي.د دې میکانیزم نور جزییات به په راتلونکي کې اړین وي، د لا دقیق بایو کیمیکل تحلیل او د لوړ ریزولوشن PACT ساختماني تحلیل په کارولو سره.
پخوانیو څیړنو راپور ورکړی چې DARS-AS1 د ډیری میکانیزمونو له لارې د حجرو پراختیا ته وده ورکوي 51,52,53.په یوه بیلګه کې، څیړونکو ولیدل چې DARS-AS1 د پښتورګو سرطان حجرو کې د miP-194-5p په نښه کولو سره خپل انټي سینس پروټین کوډ کولو DARS جین لوړ کړی.په هرصورت، په اوسني څیړنه کې، د DARS-AS1 دستګاه د سرطان په ډیری ډولونو کې د DARS لیږد باندې لږ اغیز درلود، په شمول لږترلږه د کولوریکټال، سینې، او جگر سرطان.ځکه چې lncRNAs د حجرو او نسج ځانګړي بیان نمونې نندارې ته وړاندې کوي، فعال میکانیزمونه ممکن د سرطان ډولونو کې خوندي نشي، کوم چې ممکن زموږ د کتنو او د مختلفو سرطانونو پخوانیو ارزونو ترمنځ د دې توپیر سره مرسته وکړي.د مختلف فیزولوژیکي او رنځپوهنې پروسو ځانګړي میکانیزمونو روښانه کولو لپاره ځانګړي مطالعاتو ته اړتیا ده.
د کلینیکي معلوماتو تحلیل ښودلې چې په تومورونو کې د DARS-AS1 څرګندونه د سرطان ناروغانو ژوندي پاتې کیدو سره متضاد تړاو لري ، کوم چې د سرطان په تشخیص کې د DARS-AS1/PACT/PKR محور اهمیت په ګوته کوي.په پایله کې، زموږ څیړنه ښیي چې DARS-AS1 د PACT/PKR سیګنال محور تنظیم کوونکی دی، د سرطان د حجرو پراختیا ته وده ورکوي، او د فشار غبرګون په جریان کې د اپوپټوسس مخه نیسي، کوم چې د څیړنې بله کرښه چمتو کوي او د احتمالي درملنې په اړه د راتلونکي څیړنې لپاره دلچسپي لري. .
د انساني حجرو لاینونه SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 او HEK293T په چین کې د ملي سیل لاین سرچینې زیربنا څخه ترلاسه شوي.ټولې حجرې په DMEM میډیم کې ساتل شوي (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) د 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) او 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) سره په 37°C، 5% CO2 سره ضمیمه شوي.انکیوبیټر
د PACT ضد، ابکم (ab31967)؛د PKR ضد، ابکم (ab184257)؛د PKR ضد (فاسفو-T451)، ابکم (ab81303)؛د بیرغ ضد، ابکم (ab125243)؛د eIF2α ضد، ابکم (A0764));د eIF2α ضد (فاسفورس S51)، ابکم (ab32157)؛د PACT ضد (فاسفورس S246)، Abgent (AP7744b)؛د β-ټیوبلین ضد، CST (2128)؛نورمال موږک IgG، CST (5415S)؛عادي خرگوش IgG، CST (2729S).انټي باډي په PBST کې په 1:1000 د ویسټرن بلاټینګ لپاره او 1:100 د IP لپاره کم شوي.
sgRNAs د CRISPR-ERA66 په نوم د عامه موجودې وسیلې په کارولو سره رامینځته شوي.موږ د sgRNA پراختیا لپاره د ډیفالټ وسیلې پیرامیټونه کارولي او د 3 kb سیمه کې د sgRNA پابند سایټونو د الګوریتم محاسبه شوي.په TSS کې مرکز شوی.د sgRNA oligonucleotides حوضونه په CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) کې ترکیب شوي او په انسان شوي pgRNA پلاسمیډونو کې کلون شوي (Addgene #44248).په ټولیز ډول 12 µg د انسان جوړ شوی pgRNA پلاسمیډ، 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260)، او 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) په 5 x 106 HEK106 HEK106 HEK293cm عفونت اخته شوي. حجرې (CWBIO، بیجینګ، چین) د جوړونکي لارښوونې تعقیبوي.د ویروس لرونکي سپرناټینټ د لیږد څخه 48 او 72 ساعته وروسته راټول شوي او د 0.45 µm فلټر له لارې فلټر شوي.د سکرینینګ لپاره، SW620 حجرې چې د dCas9/KRAB فیوژن پروټین څرګندوي د ویروس لیږد لخوا ترلاسه شوي.تعدیل شوي SW620 حجرې د 0.1-0.3 په MOI کې په څلورو خپلواکو انتاناتو تجربو کې د ویروس په کتابتون کې اخته شوي او د 2 ورځو لپاره د 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) سره نمونه شوي.بیا وروسته، حجرې د سکرینینګ لپاره د 500 حجرو/sgRNA لږترلږه کتابتون پوښښ سره په ویټرو کې د 18 ورځو لپاره کلتور شوي.
جینومیک DNA د QIAamp DNA د وینې Midi کټ (QIAAGEN، Düsseldorf، آلمان؛ 51183) لارښوونو سره سم استخراج شوی.په مجموع کې، د کتابتون د جوړولو لپاره په هر بیولوژیکي تکرار کې 100 μg جینومیک DNA کارول کیده.د sgRNA سیمه د PCR دوه پړاوونو لخوا پراخه شوې او د بارکوډ سره تړل شوې.
د PCR محصولات د NucleoSpin® gel او PCR پاکولو کټ (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) په کارولو سره پاک شوي او د Qubit™ HS ډبل سټنډ شوي DNA کشف کټ (Thermo Fisher Scientific; Q32854) په کارولو سره اندازه شوي.
د MTS ارزونه د حجرو د خپریدو اندازه کولو لپاره کارول کیده.حجرې د 2000 حجرو / څاه په لومړني کثافت کې په 96 څاه تختو کې تخم شوي.د حجرو نسبي شمیره هره ورځ په ټاکل شوي وخت کې د 4-6 ورځو لپاره اندازه شوې.د هر څاه لپاره، 20 μl MTS reagent (Promega) د 100 μl DMEM سره منحل شوي، د 4 h لپاره په 37 ° C کې د حجرو سره مینځل شوي، او بیا OD490 اندازه شوي.
د غیر منظم ودې ظرفیت د ساحې د جوړښت تحلیل کولو سره کشف شو.په لنډه توګه، 2000 حجرې چې د shRNA DARS-AS1 یا کنټرول shRNA سره لیږدول شوي په هرو 4 ورځو کې د متوسط ​​​​بدلون سره په خورا ټیټ ضمیمه مایکرو پلیټونو (کورنینګ) کې کلتور شوي.سپیرایډونه د 14 ورځو وروسته شمیرل شوي.500 حجرې چې د DARS-AS1 overexpression پلاسمیډ یا د کنټرول پلاسمیډ سره لیږدول شوي د ودې ارزونې لپاره کارول شوي ، که نه نو میتود بدل شوی و.
RNA د T7 RNA پولیمریز او بایوټین-16-UTP (Roche 1138908910) په کارولو سره د Riboprobe® ترکیب سیسټمونو (Promega P1440) لارښوونو سره سم لیکل شوی.هغه پریمرونه چې دلته کارول کیږي په 4 ضمیمه جدول کې لیست شوي دي.
د پروټین کوډ کولو PACT یا PKR سیمې په pET15b (Addgene #73619) کې کلون شوي او په BL21 (DE3) بدل شوي.دا باکتریا د شپې په LB کې د امپیسیلین سره چمتو شوي او بیا د تازه LB سره 100 ځله کم شوي.کله چې د منځنۍ کچې OD600 0.8 ته ورسید، 1 mM IPTG د پروټین بیان هڅولو لپاره اضافه شو.د شپې له انکیوبیشن وروسته (250 rpm په 20 درجې سانتي ګراد کې) سره، د حجرو ګولۍ د سینټرفیوګریشن (4000 rpm، 10 دقیقې، 4 درجې سانتي ګراد) په واسطه راټولې شوې.د لیسز بفر (50 mM Tris، pH 8.0، 250 mM NaCl، 1 mM PMSF) کې د حجرو ګولۍ بیا ځای په ځای کړئ او د 30 دقیقو لپاره په یخ کې سینګار کړئ، بیا سونیکیټ (15 دقیقې، 5 s آن/بند، په یخ کې) او سینټرفیوج (1300، 1300) rpm).، 30 دقیقې، 4 ° سی).سوپرناټینټ بیا په 4°C کې 3 ځله په Ni-NTA رال (QIAGEN) کې بار شوی، 4 ځله د واش بفر سره مینځل شوی (50 mM Tris، pH 8.0، 40 mM imidazole، 250 mM NaCl) او په ټولیز ډول 3 ځله خارج شوی. د 10 ml eluent buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).پاک شوی پروټین د WB په کارولو سره ټاکل شوی و او غلظت یې د Qubit™ پروټین اسیس کټ (Thermo Fisher Scientific؛ Q 33212) په کارولو سره ټاکل شوی و.
د RIP ارزونه لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي، د تعدیلاتو سره ترسره شوي.په لنډه توګه، د 1x RIP بفر (25 mM Tris-HCl، pH 7.5، 100 mM NaCl، 0.5٪ NP-40، RNasin ribonuclease inhibitor (Promega)، PMSF (Beyotime Biotechnology)، 1 mM DDM، protease10000mM DDM، protease 100000000 mM NaCl. (Roche, 1 mM DTT) او په 13,000 rpm کې سنټرفیوج د 15 دقیقو لپاره په 4 °C کې.سوپرناټینټ بیا د پروټین A+G مقناطیسي موتی (Millipore) سره د 5 μg د PACT ضد انټي باډي (Abeam) یا IgG (CST) سره یوځای شوی و.مچۍ 5 ځله د 5x RIP بفر سره مینځل شوي ، بیا د پروټیناز K (NEB) سره هضم شوي.RNA د Trizol سره استخراج شوی او د RT-qPCR لخوا ټاکل شوی.پرائمرونه په ضمیمه جدول 5 کې وړاندې شوي.
د ویټرو RIP ارزونه د تعدیل شوي معیاري RIP ارزونې پروتوکول سره سم ترسره شوې.په ټولیزه توګه 5 pmol in vitro transscribed RNA د RIP بفر سره 1x منحل شوی او د 5 دقیقو لپاره په 65 ° C کې د انکیوبیشن پواسطه اینیل شوی او وروسته د خونې تودوخې ته ورو یخ کول.په ټوله کې 5 pmol ثابت یا بدل شوي پرچم لیبل شوي PACT پروټینونه د E. coli څخه پاک شوي.د بیا جوړ شوي RNA سره د 2 ساعتونو لپاره په 4 درجو سانتي ګراد کې کیږدئ او د بیرغ ضد IP لپاره د RIP تحلیل لپاره پورتنۍ کړنلاره تعقیب کړئ.
د RNA توسیع تحلیل لپاره، 1 × 107 حجرې د 1xRIP بفر سره لیز شوي.په 13,000 rpm کې د 15 دقیقو لپاره په 4 درجې سانتي ګراد کې سنټرفیوګیشن وروسته، سپرناټینټ د 30 μl streptavidin مقناطیسي مرمۍ (Beckman) سره د 2 h لپاره په 4°C کې پری درملنه شوی.بیا پاک شوی لیسټیټ د خمیر tRNA سره چمتو شوی او د شپې په 4 درجو C کې د 40 pmol تازه شوي RNA سره مینځل شوی ، بیا د نورو 2 ساعتونو لپاره او 20 μl نوي سټریپټاویډین مقناطیسي موتي د BSA سره بلاک شوي اضافه شوي.د مینځلو مرحله د 5x RIP بفر سره 4 ځله او د 1x RIP بفر سره 4 ځله جوړه شوې.اړونده پروټینونه د بایوټین ایولوشن بفر (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) سره جلا شوي او په NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris Gel (Invitrogen) کې جلا شوي.د سپینو زرو داغونو وروسته (Beyotime بایو ټیکنالوژي)، ځینې بانډونه د MS لخوا تجزیه شوي او تحلیل شوي.
د Co-IP تحلیل د PACT او PKR ترمنځ د متقابل عمل ازموینې لپاره ترسره شوی.په لنډه توګه، سپرناټینټ لیزیټس په 1 x RIP بفر کې د 1 x 107 lysed حجرو انکیوب کولو سره چمتو شوي او بیا په 13,000 rpm کې د 15 دقیقو لپاره په 4 درجې سانتي ګراد کې سنټرفیوګریشن لخوا چمتو شوي.Lysates د پروټین A + G مقناطیسي مرمۍ سره بار شوي، د 5 µg انټي PACT انټي باډي سره یوځای شوي، او د شپې په 4 درجو کې په نرمۍ سره ګرځیدلي.مرۍ 3 ځله د 5×RIP بفر سره مینځل شوي ، دوه ځله د 1×RIP بفر سره او د 1×SDS بفر سره مینځل شوي.ترلاسه شوی پروټین د SDS-PAGE جیل لخوا تحلیل شوی او د WB لخوا کشف شوی.
د PACT دوه pmol او PKR 1 pmol د ای کولی څخه پاک شوي.په 1× RIP بفر کې غوړ کړئ او د 10 pmol بیا جوړ شوي RNA سره د 2 ساعتونو لپاره په 4 درجو سانتي ګراد کې سینګار کړئ.له هغې وروسته، دوی د اضافي دوه ساعتونو لپاره د پروټین A+G مقناطسي مالا - کنجګیټ شوي انټي لیبل شوي انټي باډي سره ونښلول شول.بیا موزونه څلور ځله د 1x RIP بفر سره مینځل شوي او د 1x SDS بفر سره مینځل شوي.پایله شوې PACT او PKR د WB لخوا کشف شوي.